新型PCR检测技术解析课件

1、第15讲新型PCR检测技术回顾上节课所学PCR五个要素模板：单链或双链DNA引物：16-30 bp合成的寡核苷酸DNA聚合酶：耐热的Taq底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP)液态反应体系：其中Mg2+是DNA聚合酶的激活剂基本程序94 30s 变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）72 n(按1扩增1kb计算）延伸 25-35个循环基本内容一、多重PCR二、荧光定量PCR的原理三、实时荧光定量PCR的原理四、实时荧光定量PCR与常规的PCR的差别五、实时荧光定量PCR的应用六、课堂小结七、作业一、多重PCR1、定义： 它是在同一PCR反

2、应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。 区别在多对引物需要设计。2、多重PCR的步骤：多重PCR扩增区域的选择。多对引物的设计。反应条件的选择及反应体系的优化（引物浓度、模板浓度、dNTP及酶的浓度、Mg2+浓度、加入DMSO、甘油或者BSA、PCR循环参数的设定）。结果分析一、多重PCR一、多重PCR3、多重PCR的特点高效性 在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。系统性 多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞

3、厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。经济简便性 多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。一、多重PCR4、多重PCR的应用（5个实例）例一 肝炎病毒的感染，在同一病人体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染。有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.一、多重PCR4、多重PCR的应用（5个实例）例二 肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病. 一、多重PCR4、多重PCR的应用（5个实例）例三 性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病

4、的诊断. 战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检. 需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.一、多重PCR4、多重PCR的应用（5个实例）例四 某些遗传病及癌基因的分型鉴定。遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位 ，通过常规PCR很难检测出来。例五 植物种质鉴定、植物病毒的检测、分子育种、快速检测外源基因的整合状态。一、多重PCR二、荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。二、荧

5、光定量PCR的原理荧光定量PCR最常用于基因表达产物的分析，即将转录生成的单链mRNA逆转录成双链的cDNA,以此cDNA为模板进行反应。（动画） 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。1、 荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物

6、形成完全同步。 荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。 二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针 二、荧光定量PCR的原理 2、荧光染料 在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。二、荧光定量PCR的原理2、荧光染料二、荧光定量PCR的原理2、

7、荧光染料二、荧光定量PCR的原理观看视频动画荧光探针特异性高探针设计要求高合成费用高多重PCR检出荧光染料简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR二、荧光定量PCR的原理3、荧光探针和荧光染料的区别荧光探针SNP解析病毒、病原菌的检测荧光染料mRNA表达量分析二、荧光定量PCR的原理4、荧光探针和荧光染料的用途三、实时荧光定量PCR的原理 1、Ct 值 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 - Ct值。 C代表Cycle，t代表threshold（临界值）。 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 。 2、Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该

8、模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。三、实时荧光定量PCR的原理 三、实时荧光定量PCR的原理 Ct起始拷贝数或起始浓度标准曲线三、实时荧光定量PCR原理3、数据测定 在实时荧光定量PCR的反应体系中，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。 再利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。 三、实时荧光定量PCR原理3、数据测定三、实时荧光定量PCR原理3、数据测定Rn (荧

9、光信号)循环数Cycle Number三、实时荧光定量PCR原理3、数据测定操作过程四、实时荧光定量PCR与常规PCR的差别2、分析对象的差别：1、原理的差别：动画视频四、实时荧光定量PCR与常规PCR的差别3、使用仪器及结果输出形式的差别：五、实时荧光定量PCR的应用1.病原体检测 2.产前诊断 3.药物疗效考核 4.肿瘤基因检测 5.新药开发研究 6.超早期感染用药物及疗法的研究与开发 1、病原体检测 目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测

10、定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。五、实时荧光定量PCR的应用2、产前诊断 到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生。 如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。五、实时荧光定量PCR的应用3、药物疗效考核 比如，对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感。 五、实时荧光定量PCR的应用 癌基因的表

11、达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。 目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。五、实时荧光定量PCR的应用4、肿瘤基因检测 5、新药开发研究 针对一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、细菌病等，在新药的开发过程中，快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金，与以前所用的常规方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量，因此有利用分析药物的作用效果，为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。 五、实时荧光定量PCR的应用6、超早期感染用药物及疗法的研究与开发 实时荧光定量PCR方法测