高通量测序技术在微生物多样性与功能研究方面的应用

1、高通量测序技术在微生物多样性与功能研究方面的应用一、高通量测序技术简介进入21世纪，随着基因组计划的完成，人类进入后基因组时代，对测序技 术的迫切需求，促使测序技术迅猛发展，进而形成第2代测序技术一一高通量测 序的时代。其中最具代表性的测序平台包括罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGS FLX Sequencer，lllumina 公司的 Solexa 基因组分析仪(lllumina Genome Analyzer)和 ABI 的 SOLiD 测序仪(ABI SOLID Sequencer)。1、Illumina Genome Analyzer和 HiSeq 2000IIllumi

2、na公司的新一代测序仪(包括CenomeA nalyzer及其升级版HiSeq 2000) 利用基于单分子簇的边合成边测序技术 (Seque ncing by Syn thesisSBS和专有的可 逆终止化学反应，可以在短时问内获得大量数据。测序特点：通量高，目前一台机器在两周内最高可产出360 G的数据；准确率高，98.5%同时也有效地 解决了多聚重复序列的读取问题； 成本低，低于传统San ger测序技术成本的 1%;DNA序列的读取长度不断增加，当前单条序列读长可达到150 bp；可以进行Pair-End(PE)双向测序，PE文库插入片段大小范围可由150 bp到10 kb。 正确选择插

3、入片段长度有利于高重复序列含量基因组的组装，这进一步扩展了该技术的应用范围。2、Roche GS FLX Titanium System2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测 序系统一Genome Seque ncer 20 System被N ature杂志以里程碑事件报道，开 创了新一代测序技术的先河。测序特点： 速度快，一个测序反应耗时10 h,获 得4-6亿个碱基对，比传统的San ger测序的方法快100倍；读长长，单条序列 的读长平均可达到450 bp；通量高，每个反应可以得到超过100万个序列读长； 准确度高，读长超过400 bp时，单一读长的准确

4、性可以超过 99%;可以进行 Pair-E nd测序研究。3、AB SOLiD systemAB SOLiD sequencer是由ABI公司研发的新一代高通量基因测序分析系统， 该技术以用四色荧光标记寡核苷酸进行连续的连接反应为基础，能够对单拷贝扩增的DNA片段进行大规模高通量并行测序，根据双碱基编码原理进行数据比对。测序特点：可制备Mate-paired文库测序，插入片段范围600 bp一 10 kb；通 量高，每台SOLiD4 System测序仪在15天内能够获得100 G的数据量；采用 Primer reset方式，保证了较低的噪音，失败的Round可以重做；测序时采用连 接反应，稳定

5、性高，准确性高，有效地解决了多聚核苷酸序列困难读取的问题； 每个DNA碱基检测2次，这增加了序列读取的准确性。二高通量测序技术在转录组学研究中的应用实例转录组学(transcriptomics)，是一门在RNA水平上研究细胞中基因转录的整 体情况及转录调控规律的学科。研究转录组最为广泛的方法是利用微阵列 (microarra y)技术检测有机体基因组中基因的表达。近年在微阵列技术基础上改进 的瓦片阵列(tiling array)技术，使用了覆盖全基因组、相互交叠的探针，能够更精 细的揭示RNA世界的状态和变化情况。该技术己经被成功应用到多种细菌的研 究中。但除了存在背景干扰，饱和度，探针密度和

6、质量等影响实验准确度的因素 外，微阵列技术的最大缺点是无法进行 de novo转录组研究。芯片探针设计要倚 赖于己有的参考基因组序列，不能发现每株菌特有的转录序列以及这些序列的表 达水平变化。而使用RNA-seq方法，对全基因组cDNA进行高通量测序，可以 从根本上解决这个问题。2009 年，Yoder-Himes等使用 lllumina 测序方法，在 Burkholderia ceuocepacia 中发现了 13种未知ncRNA。并且发现尽管基因组相似度很高，来源不同的 B.ce no cepaciaW菌株在调节反应上相差甚远，这或许可以解释他们栖息环境和致 病潜力的差异。Passalac

7、qua同时使用Illumina和ABI SOLiD两种测序技术， 研究炭疽芽抱杆菌不同生长阶段和芽抱形成过程中的转录改变，两种技术的结果表现出很好的相关性。通过该研究，对炭疽芽抱杆菌的全基因组转录起始位点和 操作子结构进行了预测，发现许多以前未被注释的基因组区域也表现出显著的转 录活性。在伤寒沙门氏菌的RNA-seq研究中，Perkins等发现了 40个新的ncRNA 序列，根据RNA-seq的结果对基因组序列的注释信息进行了校正，并找到OmpR操纵子的一些新成员。Cynthia等对幽门螺杆菌的转录组测序研究发现，操作子 内部存在数百个与己知基因力一向相反的转录起始点，这说明其转录水平上存在的

8、高度复杂性，并为其他物种的转录调控研究提供了新思路。三、高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用2005 年以来，新一代 DNA 测序技术(Next-generation DNA sequencing的发 展，为微生物群落的分析带来了突破，群落中极度稀少的微生物如今也能被检出， 并可以更精确地测定生境中各类微生物的相对丰度。新一代的测序技术(如焦磷酸测序技术，pyroseque nci ng为微生物生态学提供了全新的技术手段，具有极为 广阔的应用前景。以往文献报道肠道菌群与人类代谢疾病之间存在着某种关联，为了研究糖尿病与肠道微生物的关系，Nadja Larsen等人以18个II型糖尿病男性患

9、者及18个 正常男性为研究对象，采用454高通量测序技术对其粪便中微生物16S rRNA基因的V4区进行了测序。序列分析结果发现这些序列分属于五个门的微生物，包 括壁厚菌 门(Firmicutes)、拟杆菌 门(Bacteroidetes)、变形杆菌 门(phyla Proteobacteria) 放线菌门(phyla Actino bacteria)和疣微菌门(phyla Verrumicrobia)， 其中壁厚菌门和拟杆菌门所占比例高达90%以上。糖尿病患者的肠道菌群中壁厚菌门和梭菌纲(Clostridia)的含量明显低于正常人。另外，拟杆菌门/壁厚菌门以及 Bacteroidetes-P

10、revotella/C.coccoides-E.rectal的 比例与血糖浓度成正相关，但是与 身体指数却不相关。B变形杆菌(Betaproteobacteria在糖尿病患者中也大量富集现 象，并且这类细菌与血糖浓度也成正相关。以上结果揭示人类II型糖尿病的病因与肠道微生物群落组成变化有联系。为了研究饮食对肠道微生物群落多样性的影响， Filippo CD等人采用454高 通量测序技术比较了 15个健康欧洲孩子(EU)及14个健康非洲农村孩子(BF)肠道 微生物群落的组成。EU的饮食具有典型的西方特色，而 BF的食物则能代表传 统的非洲乡下的饮食构成。研究人员通过 PCR扩增29个粪便样品的1

11、6S rRNA 基因V5-V6区DNA片段并进行高通量测序，共获得了 438219条高质量的reads。 RDP数据库比对结果显示 94.2%的reads属于放线菌门(Actinobacteria)，拟杆菌 门(Bacteroidetes),壁厚菌门(Firmicutes)和变形杆菌门(Proteobacteria，然而它们 在EU和BF中的比例具有显著差异。BF肠道中拟杆菌占大部分，而壁厚菌所占 比例较低。有趣的是，含有大量纤维素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例较高参考文献：王兴春，杨致荣，等高通量测序技术及其应用J.中国生物工

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