基因工程程序课时1ppt课件

1、1.2基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序1目的基因的获取。2_的构建。3将目的基因导入_。4目的基因的检测与鉴定。基因表达载体受体细胞预习提纲:一、为什么要有“目的基因的获取”这一步？二、为什么要有“表达载体的构建”这一步？ 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。三、为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？ 四、为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？ 含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和

2、表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。2.基因文库的构建方法鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)(一)从基因文库中获取目的基因反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶H2.基因文库的构建方法DNA聚合酶双链DNA(目的基

3、因)1. 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_ 复制_ 的核酸合成技术 2.原理：_4.方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）5.结果：聚合酶链式反应体外 特定DNA片段DNA复制指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因3.过程:(变性、退火、延伸)条件：四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制PCR技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。点点生物学教学寻根问底（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，

4、并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。1. 作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子

5、、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够

6、表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因编码区上游编码区下游RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶结合位点编码蛋白质调控调控原核细胞真核细胞真核细胞1.启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录.2.终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾部，起终止转录的作用.1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。 核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表

7、达载体的构建基因表达载体的构建核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。特别提醒 用限制酶切割载体和含目的基因的DNA分子时，可以使用不同的限制性核酸内切酶,但是必须切出相同黏性末端。不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具有相同的结构和化学组成，都是双螺旋结构，都由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相同的碱基互补配对原则：AT，GC。下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoR、BamH的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性

8、基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR、BamH在内的多种酶的酶且位点。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。目的基因-载体连接物 载体-载体连接物 目的基因-目的基因连接物 分离纯化 （1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoR酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公

9、益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。启动子mRNAEcoR和BamH （3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。16（2011上海57）回答下列有关基因工程的问题。（1）基因工程中使用的限制酶，其特点是 下图四种质粒含

10、有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。（2）将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X1混合连接，连接后获得的质粒类型有。（多选）AX1 BX2 CX3 DX4特异性的识别和切割DNAABC“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。（3）若将上图所示X1、X2、X3、

11、X4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有、。（4）如果X1用E1酶切，产生850对碱基和3550对碱基两种片段：那么质粒X2（Tcr基因的长度为1200对碱基）用E2酶切后的片段长度为对碱基。无质粒细胞含X-3的细胞4750“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。（5）若将外源的Tcr基因两端用E2切开，再与用E2切开的X1混合连接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X4的细胞数与含X1的细胞数之比为13，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？。原因是不能