基因诊断和基因治疗(3)

1、关于基因诊断与基因治疗 (3)1第一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月2本章讨论二大方面内容 基因诊断 基因治疗第二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月3 一. 基因诊断概念 ： 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。第一节 基 因 诊 断第三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月4二. 基因诊断特点： 针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高 实用性强，诊断范围广 第四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月5三. 基因诊断常用技术方法 核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 生物芯片 基因测序第五

2、张，PPT共六十二页，创作于2022年6月6（一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 GC ; DNA与RNA杂交: A=U、 GC ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链碱基互补第六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月7 hybridizationDNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G

3、 T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C第七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月8 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。第八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月9 1.核酸分子杂交的分类 液相杂交

4、： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等 第九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月102.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针第十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月11 3. 常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法（Nort

5、hern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sanwich hybridization） 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）第十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月12 (1) Southern 印迹杂交法 （Southern blotting ） 限制性内切酶酶切 检测杂交信号 提取DNA Southern 法可用于检测特异的DNA序列片断、基因定位、分子量测定等。第十二张，PPT共六十二页，创作于2

6、022年6月13（2）Northern 印迹杂交法 （Northern blotting ） （其基本过程类似于上述Southern法） 提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标记DNA或RNA）与之杂交显影或显色检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA 第十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月14（3）斑点杂交或狭缝杂交法： 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上用标记探针与之杂交自显影或显色反应检测杂交信号分析结果。 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。 第十四张，PPT共六

7、十二页，创作于2022年6月15（4）菌落杂交（colony hybridization）该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。第十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月16（5）夹心杂交法（sanwich hybridization）ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探针 片断A 检测探针 本法优点： 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。第十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月17（6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。

8、细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。有第十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月18（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)技术 PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量扩增。 1. PCR基本原理： PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合

9、（复性）和延伸3个步骤的循环过程（2530个循环），目的DNA可扩增100万倍以上。第十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月19（1）DNA模板的变性 将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），并游离于反应体系中作为模板；（2）模板与引物的结合（退火或复性） 将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3端）碱基序列互补结合。（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比例远大于模板自身的复性）；第十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月20（3）引物延伸 将体系温度升到720

10、C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3端，使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。第二十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月21 PCR技术原理示意图第二十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月22 2. PCR各要素及其作用（1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝； RNA作为模板时，需要： RNA cDNA PCR, 称

11、此为RT-PCR. （2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95稳定30分钟。从而保证PCR在94变性 55退火71延伸循环30次过程中不变性失活。 在PCR中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。 逆转录第二十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月23（3）引物 引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。 引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。 引物设计原则如下：第二十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月24 引物设计应符合以下基

12、本原则： 长度适宜，一般为1530个碱基； G+C含量，一般为4060； 4种碱基应随机性分布； 引物自身不应存在互补序列； 两个引物之间不应有多于4个碱基的互补； 引物3端不应有任何修饰； 引物5可以修饰。第二十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月25（4）缓冲溶液与Mg2+ PCR技术常用1050mmol/L Tris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度；（5）dNTP浓度 PCR一般用50200mol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；第二十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月26（6）参数 变性温度与时间 一般选择： 940C，

13、30秒 退火温度与时间 取决于引物长度、浓度 和G+C含量， 一般选择： Tm - 5 延伸温度与时间 一般选择： 70 75循环次数 取决于模板浓度， 一般循环：30次第二十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月27 PCR操作 各种PCR反应的操作基本相同，只是根据 引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。 将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。 PCR技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何DNA片断。 PCR缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。 第二十七

14、张，PPT共六十二页，创作于2022年6月28 3. PCR产物分析（1）凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。 同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。 （在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）第二十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月29（2）点杂交分析法 该法有2种： 将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交； 将不同的探针固定在膜上，再用有标记的PCR产物 与之杂交。 本法有助于检测突变DNA类型，用

15、于人类遗传病诊断合某些基因的分析。 (当扩增产物时多条带时，用此法更合适。)第二十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月30 (三)生物芯片 DNA芯片或基因芯片属于生物芯片的一类。第三十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月31 (四) 基因测序 即，DNA碱基序列分析，这是最确切、最直接的基因诊断方法。 目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。 第三十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月32 四. 基因诊断的临床应用(一) 遗传病的基因诊断(二) 肿瘤的基因诊断(三) 感染性疾病的基因诊断第三十二张，PPT共六十二页

16、，创作于2022年6月33 举例： 镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子AT 表达产物：谷氨酸缬氨酸 一个碱基突变缺失1个Mst内切酶位点 正常人： 1.1kb 患者： 1.3kb第三十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月34 53 53 1.1 kb 1.3kb Mst II酶切位点（CCTNATG）正常基因突变基因1.3kb1.1kb0.2kb123 1、正常人 2、突变携带者 3、患者第三十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月35 第二节 基因治疗 基因治疗的概念 基因治疗的总体策略 基因治疗的基本程序 基因治疗的现状与展望第三十五张，PPT共六十二页，创作于202

17、2年6月36一、基因治疗概念 狭义概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。 广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。 第三十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月37二、基因治疗的总体策略 基因矫正 基因置换 基因增补 基因失活 “自杀基因”的应用 免疫基因治疗 耐药基因治疗 第三十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月38（一）基因矫正（gene correction） 对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； （二）基因置换（gene replacement） 用正常基因在原

18、位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态； 第三十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月39（三）基因增补（gene augmentation） 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除。（四）基因失活（gene inactivation）： 指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。 反义RNA: 干扰mRNA的互补RNA; 反义DNA: 干扰DNA的互补DNA.第三十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月40（五）“自杀基因”的应用 自杀基因 这种基因导

19、入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。 自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。 第四十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月41（六）免疫基因治疗 将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （七）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。第四十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月42 三、 基因治疗的基本程序（一）治疗性基因的获得 在了解疾病发生的分子机制基础上，

20、选择对疾病有治疗作用的特定基因。 如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。 治疗性基因获得的方法很多： 用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。第四十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月43（二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。 常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。 病毒载体：逆转录病毒载体， 腺病毒载体， 腺相关病毒载体等； 非病毒载体： 与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗

21、基因转移入患者体内。第四十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月44（三）靶细胞的选择 基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。 对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。 但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。 第四十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月45 人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种途径。 一种为直接体内疗法（in vivo）： 即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞； 另一种为间接体内疗法（ex vivo）： 即，在体外先将治疗基因导

22、入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。第四十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月46 治疗基因导入受体细胞的方法 化学方法物理方法膜融合法病毒载体法质粒DNA直接转移法（四）基因转移方法 磷酸钙法 DEAE葡聚糖法 电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）第四十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月47 ( 五 ) 转导细胞的选择鉴定 标记基因技术 基因缺陷型受体细胞技术 基因共转染技术 分子杂交技术 外源基因表达鉴定 ( 六 ) 回输体内 将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。第四十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月48 四、

23、基因治疗的应用与展望 (一)基因治疗应满足的条件： 1、单基因缺陷疾病 2、仅限体细胞的基因治疗 3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。 4、治疗效果应胜过对病人的危害。 5、表达水平无需调控且无副作用。 6、需经动物实验验证安全可行。 第四十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月49 （二）基因治疗有待解决的问题 1、难以获得真正有治疗作用的基因。 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有 改变。 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。 5、随机整合潜在的威胁。 第四十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月50 第五十张，PPT共六十二页，

24、创作于2022年6月51Eggs are coaxed to mature in a culture dish. Each has a remnant egg cell called the polar body and cumulus cells from the ovary clinging to it. 第五十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月52 While an egg is held still with a pipette, a needle is used to drill through the zona pellucida, removing a plug. 第五

25、十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月53 After ejecting the zona plug, the needle is inserted back in the egg through the hole to withdraw and discard the polar body and the eggs genetic material. 第五十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月54 A cumulus cell from another egg is taken up into the needle. Cells called fibroblasts (or

26、their nuclei) can also be used in this step. 第五十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月55 The cumulus cell is injected deep into the egg that has been stripped of its genetic material. 第五十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月56 The injected egg is exposed to a mixture of chemicals and growth factors designed to activate it to divide. 第五十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月57 After roughly 24 hours, the activated egg