牛结核病防控相关进展

1、牛结核病防控相关进展牛结核病人型菌牛型菌人犬猫牛马羊猪鸡病原-致病性结核分枝杆菌属 人型菌 & 牛型菌基因水平上99.95%同源感染谱相互交叉10%结核病人感染牛型菌人型菌可感染牛 (Chen, 2009)结核病防治的新挑战？人 -牛人型与牛型结核菌结核菌在人与牛之间的传播除非扑灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。 世界卫生组织第七次专家委员会报告牛结核是可以控制的美国1917年开始根除计划，用约50年宣布根除牛的牛结核，但野生动物依然存在感染英国每年约花费7000多万英镑控制牛结核澳大利亚1970至1997年历时27年根除牛结核控制牛结核需要科学的方法加长期的规划根除牛结核则需国家

2、大量的投入1. 流行病学传染原：开放性结核病牛是主要的传染源 引起牛结核病原牛分枝杆菌、结核分枝杆菌。引起（人）结核病原结核分枝杆菌、牛型结核杆菌其他动物结核病原灵长类与人相似其他哺乳动物与牛相似、禽类以禽型结核杆菌为主伯杰细菌学鉴定手册分枝杆菌属为2 大类: 缓慢生长分枝杆菌快速生长分枝杆菌（通常不致病）快速生长分枝杆菌（ NTM ）目前发现NTM有150多种，仅20余种致病。代表性菌种为日内瓦分枝杆菌致HIVAIDS发生播散型NTM病，并迅速致死。I群一光产色分枝杆菌代表性菌种有：堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分枝杆菌。群一暗产色分枝杆菌代表性菌种有：瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝

3、杆菌、苏加分枝杆菌。群一不产色分枝杆菌代表性菌种有鸟一胞内复合体分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、土地分枝杆菌、嗜血分枝杆菌。群快速生长分枝杆菌代表性菌种有：偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌。缓慢生长分枝杆菌结核分枝杆菌复合物(或群) 结核分枝杆菌牛分枝杆菌非洲分枝杆菌田鼠分枝杆菌麻风分枝杆菌 禽结核分枝杆菌副结核分枝杆菌宿主牛分枝杆菌主要引起牛结核病。也引起人类结核病。有5% 10% 以上的人结核是由牛分枝杆菌引起。还可感染牛、猪、人、鹿和大象等50 种温血脊椎动物。 20 多种禽类。结核分枝杆菌主要引起人类结核病, 参考菌株为H37Rv;田鼠分枝杆菌引起鼠类结核病; 非洲分枝杆

4、菌引起人类结核病。主要感染途径为呼吸道和消化道。相对来说，成年牛易经呼吸道感染，而青年牛易经消化道感染。呼吸道感染主要由带菌尘埃或气溶胶所造成。消化道感染则常因饲草、饲料被污染。犊牛感染主要是吮吸带菌的乳汁造成的。此外，也可通过交配感染。传染途径易感动物牛人、猪、鹿和大象等50 种温血脊椎动物。20 多种禽类。影响因素饲养管理不良，使役过度，与牛结核病的传染有密切关系。特别是牛舍过于拥挤，通风不良，潮湿，光线不好，是造成本病扩散的重要因素。饲料配比不当、饲料中缺乏维生素和矿物质等，均可促进本病的发生。牛结核的分布广泛流行于世界各地尤以奶牛业发达国家为严重。地区流行或散发流行2012年全球牛结核

5、分布诊断1. 流行病学2. 症状 3. 病理变化4. 检测病原免疫学试验结核病检测胶体金-干扰素ELISAPPD皮试免疫学诊断分子生物学体液免疫细菌学诊断细胞免疫2.症状咳嗽虚弱消瘦呼吸困难咳嗽加重鼻孔干酪样鼻汁胸部干性或湿性啰音、偶尔摩擦音体表淋巴结肿大临床症状只能提示但不能确定该病。牛型结核分枝杆菌感染初期或轻度感染时，可能不出现临床症状。通常呈慢性经过，病初症状不明显，患病较久，由于患病器官不同，症状亦不一致。 症状潜伏期活动期16-45d长者达数月，甚至数年、终生无明显症状不发病肺结核肺外结核咳嗽病牛常发肺结核，易疲劳，常有短而干的咳嗽，尤其当起立、运动、吸入冷空气或尘埃时随后咳嗽加重

6、，频繁且表现痛苦。呼吸次数增多或发生气喘。消瘦消瘦，贫血，有的牛肩前、股前、腹股沟、颌下、咽及颈淋巴结等体表淋巴结肿大。当纵膈淋巴结受侵害肿大，压迫食道，则有慢性胀气症状。病势恶化，可能发生全身性结核，即粟粒性结核。胸膜、腹膜发生结核病灶时呈现所谓的“珍珠病”，胸部听诊可听到摩擦音。乳房感染多数病牛乳房常被感染侵害，可见乳房上淋巴结肿大无热无痛，泌乳量减少，乳汁初期无变化，病重时呈水样稀薄。顽固性下痢肠道结核多见于犊牛，可表现为消化不良，食欲不振，顽固性下痢，迅速消瘦。性机能紊乱生殖器官结核可出现性机能紊乱，发情频繁且表现性欲亢进，慕雄狂与不孕。孕畜流产，公畜副睾及睾丸肿大，阴茎前部可发生结节

7、、糜烂等。神经症状中枢神经系统主要是脑及脑膜发生结核病变，常引起神经症状，如癫痫样发作、运动障碍等。禽型结核分枝杆菌感染可能无临床症状，但亦可能出现昏睡和消瘦。在应激条件下，可能发生突然死亡，这往往与严重的肝脏病变有关，象这样的病变在死后解剖时容易观察到。禽型结核分枝杆菌能引起人的一种渐进性的难以治疗的疾病。因此所有操作均须在有充分生物防护装置的条件下进行。人型结核分枝杆菌感染除灵长类动物会出现咳嗽等症状外，其他动物一般无明显临床症状。3. 病理变化牛型结核分枝杆菌感染病变可发生在所有内脏器管最常见的是肺、胸膜、肠系膜淋巴结。感染早期，可在肺门部位及肺门淋巴结见到干酪样坏死或钙化的病灶。感染中

8、后期，可在胸膜、胸腔见到“珍珠状”增生，形成所谓的“珍珠胸”。在肠系膜可见到串珠状淋巴结肿大。分枝杆菌培养鉴定实验流程1、染色镜检确定是否是抗酸菌的培养阳性菌株2、确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM首先经对硝基苯甲酸(PNB)生长试验、28生长试验、耐热触酶试验、观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM。3、确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群什么型进行TCH生长试验、硝酸还原试验和烟酸试验进行菌种鉴定。 结核菌素反应与病变牛结核菌素阳性反应，但剖检时找不到病变。当牛结核病在牛群中严重流行时，遇到这种情况不多。但对于牛结核病清净的牛群，这种情况就

9、比较常见了。无病变的牛结核菌素阳性反应是不是完全属于非特异性反应？这种情况很难作出明确诊断，因为有些牛虽然感染牛型结核分枝杆菌，但病变很少或不明显，解剖时不易发现，有的感染牛没有任何病变。病原分离及鉴定病料淋巴结痰乳精液子宫分泌物尿和粪便病原检测染色镜检培养特性动物试验生化试验分子生物学诊断 染色镜检涂片先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白，甘油蛋白的配制：鸡蛋白20mL，甘油20mL，水杨酸钠，混匀。如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，用二甲苯或乙醚脱脂12分钟后倾去，再滴加95酒精以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。然后吸取标本滴加其上，涂布均匀。萋尼氏抗酸染色涂片后，经火焰固定加石

10、炭酸复红染色液用100mL 95酒精加3g碱性复红配制成碱性复红饱和酒精溶液，取碱性复红饱和酒精溶液10mL，与5苯酚溶液90mL混合后用滤纸滤过将玻片在火焰上加热至出现蒸汽（不能产生气泡），如此热染5分钟（如染色液干涸，须加适量补充）。水洗后滴加3盐酸酒精脱色3060秒（至无色素脱下为止）浓盐酸3mL，95酒精97mL，混匀。水洗后，以骆氏美兰染色液复染1分钟。甲液：美兰，95酒精30mL。乙液：氢氧化钾溶液100mL。混合即成水洗，吸干，镜检。抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色，其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成兰色。菌体形态牛结核分枝杆菌呈细长平直或微弯曲的杆菌，长微米，宽微米

11、.在陈旧培养基上或干酪性淋巴结内的菌体，偶而可见长达10微米或更长培养将经过处理的被检样品标本接种到培养基上（同时作24份）培养一天后，以熔化的石蜡封口，继续培养。 牛型结核分枝杆菌生长缓慢，初次分离培养时，需3637培养58周方可出现菌落。在固体培养基上不产生任何颜色，菌落湿润、略显粗糙并发脆。加1的丙酮酸钠能促进生长。若是非典型分枝杆菌，则生长较快，大部分（但不是全部）产生白色或具有橙色或黄色色素，常形成黄色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。BACTEC培养法利用放射性测定技术与培养技术相结合的一种技术。BACTEC培养法商品盒试剂。本方法的优点是：比标准培养法检测到的菌量更低，

12、培养时间更短（只需28周左右）。本法的缺点是：费用高，需专用仪器，需防止放射性污染。用动物分离豚鼠和家兔对牛型结核分枝杆菌敏感，鸡对牛型结核分枝杆菌不敏感。处理过的病料，皮下或肌肉、腹腔内注射接种后30天左右，进行禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应，可于40天左右剖检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定动物试验试验动物豚鼠兔鸡牛型结核分枝杆菌易感易感不易感禽型结核分枝杆菌不易感易感易感

13、人型结核分枝杆菌易感不易感不易感牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定生化试验：生化试验类型烟酸试验吐温80水解试验耐热接触酶试验硝酸盐还原试验尿素酶试验T2H抗性试验牛型结核分枝杆菌禽型结核分枝杆菌人型结核分枝杆菌分子生物学诊断DNA针扩增从临床样品提取的靶序列，是来自热休克基因，大小为402碱基对(bp)片段，336bp和123bp为重复片段，或者单独插入对结核分枝杆菌特异的IS986、ISl081序列。PCR报道PCR能区别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。在实际应用中，需要进一步评价其特异性，特别是敏感性。扩增片段可以看得见，可用生物素或地高辛代替同位素进行标记。免疫学试验结核菌素皮内变态反应试验全

14、血试验 淋巴细胞增生试验、干扰素试验 血清学试验ELISA、胶体金结核菌素皮内变态反应试验用结核菌素进行的皮内变态反应试验是检查牛结核病主要方法。亦是OIE指定国际贸易用检测试验。试验分2种，一种是牛型结核菌素单一试验，仅用牛型提纯结核菌素进行，目的是检测是否存在牛型结核分枝杆菌的感染。另一种是结核菌素比较试验，用牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素同时进行，这是一种鉴别诊断试验，用以明确是牛型结核分枝杆菌感染，还是禽型或副结核分枝杆菌或其他分枝杆菌感染。皮试工具判定标准中国GB/T18645-2002OIE皮内注射0.1ml(2000IU)牛结核菌素,72h后观察皮厚,96与120h再观察一次

15、牛结核菌素单用,或牛与禽结核菌素联用,不少于2000 IU,72h后观察阳性:皮厚差大于4mm阴性:皮厚差小于2mm可疑:皮厚差2-4mm疑似牛立即在另一侧用同一批PPD第二次皮试,72h后观察阳性:皮厚差大于4mm阴性:皮厚差小于2mm 可疑牛42天后重作皮试牛与禽结核菌素联用时,牛结核菌素皮厚差大于禽结核菌素皮厚差4mm为阳性,1-4mm为可疑,小于或等于禽结核菌素皮厚差为阴性结核菌素皮内变态反应的特点世界动物卫生组织OIE迄今为止唯一推荐的牛结核病的诊断方法非特异性反应重症牛敏感性低操作复杂烦琐结果判断主观性大皮内变态反应比较试验本试验采用牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素同时进行。操作

16、方法：在牛颈中部选2个点，一个在上1/3处一个在下1/3处。2个点之间的距离不得少于10cm。注射点及周围的皮肤应无异常。禽型提纯结核菌素的注射剂量为每头，含万IU。即将禽型提纯结核菌素稀释成每毫升含万IU后，皮内注射毫升。牛型提纯结核菌素的注射剂量为每头，含万IU。即将牛型提纯结核菌素稀释成每毫升含万IU后，皮内注射毫升。 结果判定a)牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。对牛型提纯结核菌素的反应为阳性（局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0 mm），并且对牛型提纯结核菌素的反应大于对禽型提纯结核菌素的反应，二者皮差在2.0 mm以上，判为阳性。对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。

17、其中即使少数牛的皮差在2.0 mm以下，甚至对牛型提纯结核菌素的反应略小于对禽型提纯结核菌素的反应（反应差小于或等于2.0 mm），只要对牛型提纯结核菌素的反应在2.0 mm以上，也应判定为牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性牛。b)禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。 对禽型提纯结核菌素的反应大于对牛型提纯结核菌素的反应，两者的皮差在2.0 mm以上，判为禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性。对已经定性为副结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0 mm以下，甚至对禽型提纯结核菌素的反应略小于对牛型提纯结核菌素的反应（不超过2.0 mm），只要对禽型提纯结核菌素

18、的反应在2.0 mm以上，也应判为禽型提纯结核菌素皮内变态反应试验阳性牛。全血试验 除了传统的结核菌素试验方法外，现有了一些新的血液诊断试验方法。淋巴细胞增生试验原理测定全血样品中致敏淋巴细胞对结核菌素PPD抗原的细胞反应性。这种试验具有科学价值，但在常规诊断中并不采用，因为试验耗时，而且前期准备以及试验操作都比较复杂(需要较长的孵育期，并使用放射性核甙酸)。然而，这种试验可用于野生动物以及动物园动物的检测r干扰素试验本试验是测定全血培养系统中淋巴因子的释放原理有特异性抗原(PPD-结核菌素)培育1624小时培育期间内，致敏淋巴细胞释放出r干扰素。用对牛r干扰素的两种MAb，作夹心ELISA法

19、。 单抗1 单抗1+干扰素 单抗1+干扰素+单抗2IFN-检测方法检测OD值并确定IFN-g 水平抽取全血 ESAT-6CFP-10有丝分裂原对照将全血转移至培养孔中,加入抗原培养过夜吸取上层血浆进行夹心ELISA检测,温育 60分钟洗涤, 加底物,作用30分钟后终止反应 TMB显色IFN-g IU/mlOD 450nm标准曲线步骤 1 全血培养步骤 2 IFN-gamma ELISA阴性对照IFN-释放检测特点 高特异性，高敏感性 外周血，24h出结果 比TST更贵，采血后在12小时内检测 BoviTB IFN-gamma kit 目前发达国家均以该方法辅助进行结核病根除计划样品不能存放，在8小时内进行。此外，这种方法仅适用于