微生物国标、欧标微生物限度对比验证SOP

1、密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数1/8医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认编制：岗位：签字：日期：审核：岗位：签字：日期：批准：岗位：签字：日期：密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数2/8立项原因：1)目前，按照现行SOP进行口罩的微生物限度检查时，微生物检出率持续偏低。2)为满足出口欧洲的口罩微生物限度标准可以满足欧洲标准，需按照欧标方法(BSEN14683:2019)进行微生物限度检查方法学适用性确认。适用范围我公司生产的医用外科口罩。方法描述方法名称具体描述BSEN14683:2019取样：需要检测的口罩样品需要

2、按照原始包装提供。5个样品从包装内的上部、底部各抽取1个。从其它位置随机各抽取3个。如果口罩包含其他附件，则应将其纳入测试。测试测试前称取每个口罩的重量。将选择的样品放入300mL的浸提液(1g/L的蛋白胨，5g/L的NaCl和2g/L的TW20)的无菌500mL瓶中。在摇床上以250rpm的速率振摇5min。振摇后，取100mL浸提液经过0.45口的薄膜过滤，过滤后将滤膜放在TSA平板表面，用于细菌总数培养。同样方法制备张滤膜放在含有氯霉素的SDA平板表面，用于真菌总数培养。TSA3035C培养3天，SDA2025C培养5天。可使用替代的等效提取方法，选择的方法需要记录于最后的报告中。最终限

3、度结果以TSA和SDA计数结果之和记。GB159792002于冋一批号的三个运输包装中至少抽取12个最小销售包装样品，1/4样品用于检测，1/4样品用于留样，另1/2样品必要时用于复检。抽样的最小包装不应有破裂，检验前不得启开。在100级净化条件下用无菌方法打开至少3个包装，从每个包装中取样，准确称密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数3/8取10g1g样品，剪碎后加入到200mL灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液。液体产品用原液直接做样液。待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数。共接种10个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45

4、C左右的熔化的营养琼脂培养基倒入5个平皿内15-20mL混合均匀，营养琼脂培养基平皿翻转平皿置35C2C培养48h后，计算平板上的菌落数。NT/SOP-8.2-03-020（现行SOP）在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的4个样品，准确称取10g1g样品，剪碎后加入到200mL灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液。待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌洛计数。共接种10个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45C左右的熔化的营养琼脂培养基倒入5个平皿内15-20mL混合均匀，再用冷却至45C左右的熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基倒入另5个平皿内1525mL混合均匀，待琼脂

5、凝固后，营养琼脂培养基平皿翻转平皿置35C2C培养48h后，计算平板上的菌落数。沙氏琼脂培养基平皿翻转平皿置25C2C培养7天后，分别于3、5、7天观察，计算平板上的菌落数，如果发现菌洛曼延，以前一次的菌洛计数为准。调查分析：基于口罩微生物检出率低，进行如下调查分析：A）可能原因：产品特性-本产品不易受微生物影响方法原因-实验耗材（浸提容器）；实验试剂（浸提液）；浸提方式（振摇频率和振摇时间）；测试方法（倾注法）；培养基种类。注：由于现行SOP（NT/S0P-8.2-03-020）参考依据为GB15979-2002,文中对于实验试剂、测试方法和培养基种类有详细描述，且文件中未有规定可以变更实验

6、方法,因此,本次调查不将以上三项作为首要调查因素。密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数4/8目前，口罩微生物限度检查具体执行过程，如下：在微生物限度室超净台下，从1个包装取4个口罩，用灭过菌的剪刀将4个口罩剪碎至一个无菌烧杯中，到入200mL的生理盐水，并用1把灭过菌的吸头压在溶液上部，保证样品浸入溶液内部。摇床振摇150rpm30min。共接种10个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45C左右的熔化的营养琼脂培养基倒入5个平皿内15-20mL混合均匀，再用冷却至45C左右的熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基倒入另5个平皿内1525mL混合均匀，待琼脂凝固

7、后，营养琼脂培养基平皿翻转平皿置35C2C培养48h后，计算平板上的菌落数。沙氏琼脂培养基平皿翻转平皿置25C2C培养7天后。调查计划1）根据产品特性，使用欧标方法进行微生物限度方法学确认2）根据方法原因，执行相关计划如下：按照现行方法进行微生物限度检查方法学适用性确认；观察口罩微生物限度检查过程，并与实验人员进行沟通确认，是否执行过程有有可能影响实验结果的因素存在；基于以上调查结果是否需要进行方法改进。执行结果记录及分析1）根据欧标方法进行口罩微生物限度方法学适用性确认结果如下关键参数汇总容器：均质袋；浸提液：1g/L的蛋白胨、5g/L的NaCl和2g/L的TW20；振摇频率：250rpm，

8、5min；操作方式：薄膜过滤。菌液组：菌液制备：本次实验菌选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，制备参照商业菌种供应商提供的方法制备，具体过程如下：密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数5/8A打开胶囊，用注射器按产品的规格取相应的的复溶液。B将复溶液注入到装有菌种的瓶中。C.将复溶的菌液放在旋涡混合仪中混匀lmin，使其充分溶解，如取样间隔超过2min，取样前还需震荡3s。操作过程：取lOOmL的浸提液（lg/L的蛋白胨、5g/L的NaCl和2g/L的TW20）放入一个薄膜过滤器内，并加入制备好的金黄色葡萄球菌0.1mL，过滤，

9、将滤膜正面向上贴于TSA平板表面。依照上述方法制备含有枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的滤膜。含有枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的滤膜贴于TSA平板表面，含有白色念珠菌和黑曲霉的滤膜贴于SDA平板表面。阳性对照组：取5个口罩剪碎放入一个均质袋中，放入制备好的金黄色葡萄球菌0.3mL，放置1分钟，再加入300mL的浸提液（1g/L的蛋白胨、5g/L的NaCl和2g/L的TW20），振摇250rpm，5min。取100mL供试液过滤，将滤膜贴于TSA平板表面。依照上述方法制备含有枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的滤膜。含有枯草芽抱杆菌和铜绿假单胞菌的滤膜贴于TSA平板表面，

10、含有白色念珠菌和黑曲霉的滤膜贴于SDA平板表面。供试品对照组：取5个口罩剪碎放入1个均质袋中，加入300mL的浸提液（lg/L的蛋白胨、5g/L的NaCl和2g/L的TW20），振摇250rpm，5min。取100mL供试液过滤，将滤膜贴于TSA平板表面。另取100mL供试液过滤，将滤膜贴于SDA表面。实验结果实验组名称菌种名称金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉菌液组4158505418密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数6/8阳性对照组4249465722供试品对照组3回收率1.00.80.91.01.1回收率计算公式邙日性对照组一供试

11、品对照组）/菌液组分析及结论根据确认结果可知测试选取的5种菌种的回收率均满足验证需求（回收率为0.5-2.0）。该方法基本上可以满足实验需求，且医用外科口罩不存在不易微生物生物生长存留的可能。结论，基于产品特性造成微生物检出率低的情况，目前看不存在。2）按照目前执行方法（国标）进行微生物限度方法学确认：菌液组：菌液制备：本次实验菌选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，制备参照商业菌种供应商提供的方法制备，具体过程如下：打开胶囊，用注射器按产品的规格取相应的的复溶液。将复溶液注入到装有菌种的瓶中。将复溶的菌液放在旋涡混合仪中混匀lmin，使其充分溶解，如取样间隔超过

12、2min，取样前还需震荡3s。取0.1mL的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌菌悬液分别加入一支TSB中；取O.lmL的白色念珠菌和黑曲霉菌悬液分别加入到1支SDB中培养操作过程：取制备好的菌悬液使用生理盐水进行10倍梯度稀释，将最终稀释级记为X，取最终稀释级X的菌悬液进行计数，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌用营养琼脂计数，白色念珠菌和黑曲霉用SDA计数。阳性对照组：密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数7/8取4个口罩剪碎放入一个烧杯中，放入制备好的金黄色葡萄球菌2mL（稀释级为X-2）,放置1分钟，再加入200mL的浸提液（生理盐水），

13、振摇150rpm,30min。取5mL供试液分别加入到5个平皿中，每个平皿加入1mL供试液，导入营养琼脂。同法分别制备5个含有枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的营养琼脂和5个含有白色念珠菌和黑曲霉的SDA。供试品对照组：取4个口罩剪碎放入1个烧杯中，加入200mL的浸提液生理盐水），振摇150rpm，30min。共接种10个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45C左右的熔化的营养琼脂培养基倒入5个平皿内15-20mL混合均匀，再用冷却至45C左右的熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基倒入5个平皿内15-25mL混合均匀，待琼脂凝固后，营养琼脂培养基平皿翻转平皿置35C2C培养48h后，计算平板上的菌

14、落数。沙氏琼脂培养基平皿翻转平皿置25C2C培养7天后。实验结果实验组名称菌种名称金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉菌液组44253553N/A阳性对照组89715N/A供试品对照组0回收率0.20.40.20.3N/A回收率计算公式（阳性对照组一供试品对照组）/菌液组分析及结论：密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数8/8由于公司方法参考的是国标GB15979-2002，文件中未对真菌有计数要求，所以本次确认中白色念珠菌和黑曲霉测试结果仅作为参考。综合金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的回收率结果可知，现行方法无法有效体现实验结果

15、。3）通过观察及实验人员沟通结果描述有余下几个问题存在：a.振摇不充分（与欧标方法目视振摇情况对比）；浸提容器不合适，使用的烧杯不能保证供试品与浸提液有效接触。总结：已确认结果，欧标方法基本可以适用口罩微生物限度检查。目前参考的国标方法不适用口罩微生物限度检查，根据国标要求现在可以针对取样容器和振摇频率和振摇时间进行调查。二阶段执行计划按照国标方法重新进行方法学确认，变更参数：将浸提容器由烧杯变更为均质袋；振摇频率由150rpm变更为250rpm；振摇时间分别进行5min、lOmin和15min的进行回收率确认。依据国标方法和欧标方法对不同三批口罩进行微生物限度检查，以便确认实际情况中两种方法

16、检查结果的差异。二阶段国标方法确认和实际检测过程之中两种检测方法的结果差距。9.l通过修改振摇频率、浸提容器和振摇时间重新进行国标方法确认菌液组：菌液制备：本次实验菌选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，制备参照商业菌种供应商提供的方法制备，具体过程如下：打开胶囊，用注射器按产品的规格取相应的的复溶液。将复溶液注入到装有菌种的瓶中。将复溶的菌液放在旋涡混合仪中混匀lmin，使其充分溶解，如取样间密级秘密文件编号医用外科口罩国标、欧标微生物限度确认版本/变更A/0页数9/8隔超过2min，取样前还需震荡3s。取0.1mL的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌菌

17、悬液分别加入一支TSB中；取0.1mL的白色念珠菌和黑曲霉菌悬液分别加入到1支SDB中培养操作过程：取制备好的菌悬液使用生理盐水进行10倍梯度稀释，将最终稀释级记为X,取最终稀释级X的菌悬液进行计数，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌用营养琼脂计数，白色念珠菌和黑曲霉用SDA计数。阳性对照组：取4个口罩剪碎放入一个均质袋中，放入制备好的金黄色葡萄球菌2mL（稀释级为X-2）,放置1分钟，再加入200mL的浸提液（生理盐水），振摇250rpm。在振摇时间5min、10min和15min时，取2mL供试液分别加入到2个平皿中，每个平皿加入1mL供试液，导入营养琼脂。同法分别制备6个含有枯草

18、芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的营养琼脂和6个含有白色念珠菌和黑曲霉的SDA。供试品对照组：取4个口罩剪碎放入1个均质袋中，加入200mL的浸提液（生理盐水），振摇250rpm，15min。共接种10个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45C左右的熔化的营养琼脂培养基倒入5个平皿内15-20mL混合均匀，再用冷却至45C左右的熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基倒入5个平皿内15-25mL混合均匀，待琼脂凝固后，营养琼脂培养基平皿翻转平皿置35C2C培养48h后，计算平板上的菌落数。沙氏琼脂培养基平皿翻转平皿置25C2C培养7天后。实验结果实验组名称菌种名称金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌黑曲霉菌液组4852391721阳性对照组5min301510196lOmin33171524615min391814247供试品对照组0回收率5min0.60.30.31.10.310min0.70.30.41.40.31