酶的催化活性与调节机制

1、酶的催化活性与调节机制3.6 酶促反应动力学3.6.1 酶与底物之间的作用酶的中间产物理论 酶分子（E）表面与底物（S）结合形成不稳定中间产物即酶-底物复合物（ES），它较底物需要较少的活化能就可继续反应，分解成产物（P）并释放酶。因此，ES 浓度决定着整个酶促反应速度。S + E ES E + P3.6.1 酶与底物之间的作用 米氏方程 当 Km= S 时，则 v = 1/2 Vmax ，即当酶促反应速度达到其最大反应速度的一半时，Km值即为此时的底物浓度，其单位是 mol/L。当 Km远大于 S 时，分母S不计，则v = Vmax S/Km，初速度与底物浓度呈一级反应。当 Km远小于 S

2、时， Km不计，则v = Vmax，初速度与底物浓度呈零级反应。v = VmaxSKm + S3.6.1 酶与底物之间的作用KmVmax12v=VmaxS/Km3.6.1 酶与底物之间的作用米氏常数（Km）的特性 Km与酶的性质有关，与酶浓度无关； Km最小的底物为该酶的最适底物； Km值与温度、pH等环境因素相关； 1/Km近似表示对底物亲和性大小； K3K1和K2时，KmKs Km随不同底物而异（酶专一性判断指标）米氏方程求解方法Lineweaver-Burk法 (双倒数法）横轴截距为-1/Km，纵轴截距 1/Vmax，斜率Km/ Vmax。缺点：点过分集中在直线左下 方，而低浓度S点因倒

3、数后误 差较大，偏离直线，影响结果。1v=KmVmax.1S+1Vmax米氏方程求解方法Hanes-Woolf法横轴截距为-Km，纵轴截 距Km /Vmax，斜率1/ Vmax。KmVmaxSVmaxv=+SKm /Vmax米氏方程求解方法Woolf-Hofstee法v = - Km.Vmaxv+SVmax /Km以vv/S作图, 得一直线。横轴截距为Vmax /Km,纵轴截距Vmax, 斜率 -Km3.6.2 单底物较复杂的酶反应多种活性中间产物 底物的抑制：酶分子上有两个底物结合位点，一为高亲和性，另一个为低亲和性。当其完全被底物占据时会抑制高亲和性位点的结合作用，使酶促反应速度降低，如果

4、糖二磷酸酶。多个活性部位：有多个亚基、多个活性中心，其动力学实验常很复杂，不符合米氏方程。E+S ES E+PE+S ES ES E+P3.6.3 pH影响下酶促反应动力学 E2- ES2- K2 K2 EH- + S ESH- EH- +P K1 K1 EH2 ESH2v = VmaxSKm) +S(1+H+ K2H+)K1(1+H+ K1+ K2H+pH对酶构象的影响即对其解离基团的影响，就是H+和解离基团间的结合与解离的变化过程3.6.4 酶的抑制动力学（1）不可逆抑制：抑制剂与酶分子中的必要基团发生共价结合，使酶失活。 按其选择性差异，不可逆抑制剂分： 专一性：仅与活性部位有关的基团反

5、应； 非专一性：可与几类基团反应。如有机磷、砷、重金属（Ag、Pb、Hg）、氰化物 (沙林毒气）、CO及青霉素等。3.6.4 酶的抑制动力学（2）可逆抑制： 竞争性抑制：加入 I 后，Vmax不变，Km变大(KmKm)I与S结构相似, 但E不能同时与S和I结合3.6.4 酶的抑制动力学（2）可逆抑制：非竞争性抑制： 加入 I 后，Vmax变小，Km不变(Km=Km)3.6.4 酶的抑制动力学（2）可逆抑制：反竞争性抑制： 加入 I 后， Km 和Vmax都变小，且KmKm , Vmax Vmax3.6.5 双底物酶促反应动力学顺序有序反应 (如NAD+或NADP+的脱氢酶) A B P Q E

6、 E EA EAB EPQ EQ顺序随机反应 (如肌酸激酶使肌酸磷酸化反应)乒乓反应或双-置换反应 (如氨基酸转移酶) A P B Q E E EA FP F FB EQ四、酶的调节作用生命现象调节和控制层次： 整体水平调控：神经系统和激素； 器官、组织和细胞水平调控：体液； 分子水平调控：酶为中心的调控。酶分子的调控方式：环境因素调控、别构调控、共价调控、酶原激活调控、分子聚合调控。4.1 酶自身活性的调控4.1.1 环境因素调控环境因素改变使酶构象稳定的力的平衡;环境因素的种类：pH 、温度、金属离子、有机溶剂等；例如溶菌酶：在细胞内合成后即具有完整的空间结构，但细胞内pH值约为中性，酶的

7、活力很低，当溶菌酶分泌到细胞外偏酸性环境中pH 5时，溶菌酶的活性显著提高。 别构酶的调控别构酶的特点：一般有多个亚基, 分子量大，结构复杂。有负责调节的别构中心和负责催化的活性中心。两中心位于不同亚基, 或同一亚基的不同部位。别构效应：调节物或效应物与别构中心结合后，诱导或稳定酶分子的某构象，使酶催化中心的催化作用受到调节，从而调节酶反应速度和代谢过程。同促效应：酶分子上有两个以上底物结合中心，通过酶上结合底物分子数量而调节其活性。异促效应：通过非底物分子的结合调节其活性。 别构酶的调控别构酶的动力学特征：不遵循米氏动力学方程，具有正协同效应和负协同效应。 故有米氏活力酶、负协同效应酶和正协

8、同效应酶的区分（Koshland规则） Rs 为协同指数，n代表协同系数（Hill系数）。Rs=81：米氏方程; Rs 81：正协同; Rs 81：负协同。酶与配基结合达到0.9饱和度时的配基浓度酶与配基结合达到0.1饱和度时的配基浓度Rs= 811/n 别构酶的调控别构酶机理模型 MWC模型（齐变模型）：1965年Monod, Wyman和Changeux提出。 无RT混合态 别构酶的调控别构酶机理模型KNF模型（序变模型）：1966年Koshland, Nemethy 和Filmer提出无RT平衡态存在RT混合态 别构酶的调控研究得较为清楚的别构酶是E. coli. 天冬氨酸转氨甲酰酶(A

9、TCase), 它催化下列反应： 这个反应是合成CTP的第一步, 它受终产物CTP反馈抑制, 而被ATP激活。酶反应速度与底物浓度的关系曲线为S型, 说明底物有正协同性。加入负效应物CTP,活力降低, S型更明显。加入正效应物ATP, 活力升高, S型趋势变小，接近双曲线。大多数别构酶均有这种S型曲线。 氨甲酰磷酸 + L-Asp N-氨酰基-L-Asp +磷酸 别构酶的调控别构酶用加热、化学试剂或其它方法处理后，它仍具有活力，但丧失了酶的调节性质。如ATC酶经过温和的化学处理, 如用对羟基汞苯甲酸（PCMB）处理可解聚为两个催化亚基（为三聚体）和 3个调节亚基（为二聚体）。催化亚基仍有催化活

10、力, 但不再受效应物影响, 调节亚基无催化活力, 但仍能结合效应物。更剧烈的处理, 如用SDS处理, 则催化亚基和调节亚基都各解聚成6个单体。 别构酶的调控ATC酶受CTP抑制的生物学意义是避免合成过多的CTP, 而受ATP激活是为了保持嘌呤和嘧啶核苷酸合成的速度相称, 以满足合成核酸的需要。别构酶在代谢调节中起着重要的作用。在合成代谢中催化第一步反应的酶或分支点的第一个酶往往是别构酶，以避免形成一系列过多的中间体和终产物。在分解代谢途径中，则有一个或几个关键酶为别构酶。 别构酶的调控如糖酵解途径中的磷酸果糖激酶是一个重要的调节酶，它受ATP抑制，而AMP可逆转 ATP的抑制作用。故当 ATP

11、AMP比值降低时，也就是细胞内能荷降低时，糖酵解被促进，从而提供较多的能量。4.1.3 共价调节酶通过在酶蛋白某些氨基酸残基上增、减基团的办法调节酶的活性态与非活性态间的相互转化（可逆）。有些酶存在两种形式，在其它酶的共价修饰后可以相互转变，如磷酸化酶催化下述反应：磷酸化酶a: 不依赖AMP即有活性; Ser-14磷酸化;磷酸化酶b: 依赖AMP才有活性; Ser-14无磷酸化。b a 转变需Mg2+、ATP(糖原)n + 磷酸 (糖原)n-1 + 1-磷酸-D-Glc4.1.3 共价调节酶A. 共价调节酶的类型磷酸化/去磷酸化乙酰化/去乙酰化腺苷酰化/去腺苷酰化尿苷酰化/去尿苷酰化甲基化/去

12、甲基化S-S/SH糖基化脂酰化B. 常见共价调节酶酶来源修饰机制活性变化糖原磷酸化酶真核细胞生物磷酸化/去磷酸化/磷酸化酶激酶哺乳动物磷酸化/去磷酸化/糖原合成酶真核细胞生物磷酸化/去磷酸化/丙酮酸脱氢酶真核细胞生物磷酸化/去磷酸化/激素敏感性脂酶哺乳动物磷酸化/去磷酸化/乙酰CoA羧化酶哺乳动物磷酸化/去磷酸化/谷氨酰胺合成酶大肠杆菌腺苷酰化/去腺苷酰化/黄嘌呤氧化酶哺乳动物S-S/SH/4.1.4 酶原的激活酶原激活的特点：不可逆的共价修饰调节；在正常生理条件下，酶原不会过 早地在不适当的地方激活；激活酶受抑制剂调控； 酶原的激活伴随着信号的放大。4.1.4 酶原的激活酶原激活常见的类型：

13、 A. 消化酶酶原的激活：胃蛋白酶：从N端切除42个氨基酸，胃酸或胃蛋白酶；胰蛋白酶：从N端切除6个氨基酸，肠激酶或胰蛋白酶；糜蛋白酶：内切14-15Aa，147-148Aa，胰蛋白酶；（羧肽酶、弹性蛋白酶） B凝血酶和血液凝固 内源性途径 损伤表面 激肽原 激肽释放酶 外源性途径 XII XIIa创伤 XI XIa IX IXa VIIa VII VIIIVIIIa 组织因子 X Xa X V Va 凝血酶原（II）凝血酶（IIa） 血纤蛋白原（I） 血纤蛋白（Ia） XIII XIIIa 交联血纤蛋白凝块 创伤C. 某些蛋白激素的激活胰岛素、甲状旁腺素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素等；胰岛

14、素：前胰岛素原（N端切除20信号肽）-胰岛素原（进入内质网腔，在中间切下29-35AA的C肽）-A链和B链。 人、猪和牛的C肽长度分别为31AA、29AA和26AA。D. 发育过程和酶原激活动物在发育的特定阶段，激活特定的酶发挥特殊的作用。青蛙：在蝌蚪去除尾部时，体内胶原蛋白酶被激活；哺乳动物：分娩后，子宫内部的许多胶原蛋白也被激活的胶原蛋白酶降解；蚕蛾：在蛹成蛾过程中，激活茧酶，将蚕茧降解。E. 酶分子的聚合和解聚由于酶与一些小分子调节因子的非共价结合，引起酶的聚合和解聚，实现酶在活性和无活性间相互转化。如Glu脱氢酶和乙酰CoA羧化酶乙酰CoA羧化酶：催化脂肪酸合成。亚基的聚合和解聚，构成

15、酶的三种存在形态：四个不同的亚基 原体 多聚体 无活性 无活性 有活性ATP-Mg2+柠檬酸异柠檬酸常见酶的聚合和解聚与酶活性酶来源聚合/解聚影响因素活性变化磷酸果糖激 酶兔骨骼肌聚合解聚F-6-P, FDPATP异柠檬酸脱 氢 酶牛心聚合解聚ADPNADH苹 果 酸脱 氢 酶猪心单体二聚体NAD+谷 氨 酸脱 氢 酶牛肝聚合解聚ADP，LeuGTP (GDP)4.2 参与代谢调控的酶4.2.1 细胞空间上酶分布的分隔性： 不同部位分布不同的酶，保证生物反应不互相干扰。如脂肪酸的氧化和合成分处于线粒体内外，细胞液中的脂酰CoA需经肉毒碱脂酰基转移酶I和II催化，才能进入线粒体内进行-氧化; 而

16、胞液要进行脂肪酸合成，线粒体中的乙酰CoA需经柠檬酸合成酶催化，与草酰乙酸缩合成柠檬酸(三羧酸转运体系)，进入细胞液后，再经柠檬酸裂合酶催化，释放出乙酰CoA, 参与脂肪酸合成。 细胞膜中的酶负责个区域间传送代谢物及离子。周围蛋白：果糖二磷酸醛缩酶、甘油醛磷酸脱氢酶等。与磷脂的极性头部由静电引力相连，易于用盐溶液抽提出来；镶嵌蛋白：氨基肽酶、-D-葡萄糖苷酶、腺苷酸三磷酸酶等。与磷脂的烃链因疏水作用而结合, 只能用去污剂或有机溶剂抽提出来。 细胞核中的酶核液中的酶：糖酵解酶群，戊糖磷酸途径酶群，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶；与染色质结合的酶：DNA核苷酸转移酶, RNA核苷酸转移酶

17、II和III等；核仁中的酶：核糖酶，RNA甲基转移酶, RNA核苷酸转移酶I等；核膜酶：葡萄糖-6-磷酸酶，酸性磷酸酶等。 线粒体中的酶间质：三羧酸循环酶群，脂肪酸-氧化酶群，丙酮酸羧化酶，谷氨酸脱氢酶等；内膜：NADH脱氢酶+呼吸链，腺苷三磷酸酶，己糖激酶，细胞色素C氧化酶等；内外膜间空隙：腺苷酸激酶，核苷酸磷酸激酶等；外膜：NADH脱氢酶，细胞色素b5还原酶，胺氧化酶，胆碱磷酸转移酶，磷酸脂酶A2，酰基CoA合成酶等。 溶酶体中的酶含60多种水解酶, 多适用于酸性反应。蛋白水解酶：组织蛋白酶，弹性酶，胶原酶等；糖苷水解酶：溶菌酶，-D-葡萄糖胺酶等；核酸水解酶：DNase II，RNase

18、 II；脂类水解酶：磷酸脂酶A1和A2等；其他：酸性磷酸酶、芳香基硫酸酶等。 内质网酶蛋白质的合成和传送、脂肪酸的合成及外来物质的代谢的场所。平滑内质网：胆固醇合成酶，肉毒碱脂酰转移酶、药物代谢酶等；粗内质网（胞液面）：蛋白质合成酶，葡萄糖-6-磷酸酶、ATPase等；粗内质网 ( 腔面 ) ：核苷二磷酸酶， -D-葡萄糖苷酶等。 胞液酶碳水化合物代谢酶群：糖酵解酶群，糖原合成酶，戊糖磷酸代谢途径酶群等；脂类代谢酶群：乙酰CoA羧化酶，脂肪酸合成酶系等；氨基酸和蛋白质代谢酶群：天冬氨酸氨基转移酶，氨酰tRNA合成酶等；核酸合成酶：核苷激酶，核苷酸激酶等。4.2.8 限速步骤中调控作用的关键酶在

19、代谢反应中有一些反应实际上只有一个方向；这一类酶一般为别构酶。 如：糖酵解中的磷酸果糖激酶，催化1-磷酸果糖生成1, 6 - 二磷酸果糖； 还有硫激酶( 脂酰CoA 合成酶)、硫酯酶、乙酰羧化酶、丙二酰CoA脱羧酶等。4.2.8 限速步骤中调控作用的关键酶同工酶：理化性质不同,而催化相同反应的一类酶.对细胞生长、发育、遗传及代谢调节都很重要。不同脏器来源的同工酶，依机体需要，完成同一代谢任务，如LDH1-5。相同脏器来源的同工酶，各自起催化作用。如在肝脏中己糖激酶和葡萄糖激酶，都可以催化葡萄糖磷酸化，但在正常血糖浓度范围内，只有己糖激酶达到最大反应速度，而葡萄糖激酶不同，在血糖浓度增高时，催化

20、反应速度也同时增长。4.3 酶调控作用的机制酶调控作用的连锁性和放大作用 如激素-cAMP调节系统。酶调控作用的反馈性：即某一序列反应的终产物(效应物)对催化该反应序列第一步反应的酶(常为别构酶)所呈现的效应，分正、负反馈。 如E.coli 天冬氨酸和氨甲酰磷酸合成CTP, CTP能反馈抑制催化第一步反应的酶，即天冬氨酸甲酰基转移酶（ATC），从而减慢其自身的合成；当由于代谢活动使CTP浓度减低很多时，此抑制减弱。4.3 酶调控作用的机制酶合成的诱导和阻遏：诱导剂、诱导作用和诱导酶 许多细菌如E.coli 能在Glc培养基上正常生长发育，却不能立即利用Gal。若将其移入含Gal培养基，2min

21、后。它们能合成利用Gal的三种酶即-Gal苷酶、Gal苷通透酶和硫Gal苷转乙酰基酶，一旦Gal耗尽或重移回Glc培养基上，这些酶水平立即下降。4.3 酶调控作用的机制酶合成的诱导和阻遏：阻遏剂、辅阻遏剂和阻遏作用 当E.coli 培养基中有Trp存在时，参与E.coli Trp合成过程的所有酶的生成受到阻遏。操纵子模型（1961年，Monod & Jacob） 前提：A. 酶蛋白基因主要有：结构基因、操纵 基因和 调控基因； B. 基因表达共同控制部位：操纵子单位如 Gal 操纵子。4.4 兴奋性和抑制性调控蛋白兴奋性调控蛋白 糖原磷酸化酶激酶(PhK)由（）4 组成, 催化亚基为, 和亚基

22、为别构亚基,最令人感兴趣的是, 它是一种钙调蛋白。抑制性调控蛋白 这类蛋白与酶结合紧密，如牛胰蛋白酶抑制蛋白与胰蛋白酶结合后，解离常数只有10-13 M。在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在，可能对于调节激活后的水解酶具有作用。五、 酶活性分析5.1 酶活性概念: 催化一定化学反应的能力酶活性单位（U）：单位时间内催化一定底物消耗和产物生成量的酶量.(U/ml U/g)IU：25C、最适底物浓度、最适pH值、最适缓冲液等条件下，每分钟催化1mol/ L 底物转化的酶量。Katal（Kat）：最适条件下，每秒钟催化1mol/L底物转化的酶量。IU和Kat换算关系: 1Kat=6107IU5.2 影响酶活性的因素底