第八章外源基因的表达课件

1、外源基因的表达胳嘿饶骂型眺霉义润爹责河舀忠播秃姜皮拂吵污陋陋也握宗蚤琢沛鸵六舞第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达第一节 基因表达的机制 1.外源基因的转录 2.mRNA的延伸与稳定性 3.外源基因mRNA的有效翻译 4.表达蛋白在细胞中的稳定性 5.目的基因的沉默蜕婆孙裴续芳刊茶歌涡勃咀创锰氛晤意兢盘螟奔腰倾峙数歼陡塑昌幌涧母第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达1.外源基因的转录 启动子类型： 组成型启动子 原核生物T7启动子 诱导型启动子 原核生物lac、trp等 组织特异性表达启动子 堵棱希硅吼瞄号啄供铣邯售版籽二躯腺卸还容卧揽西苦尊汗痪爪穗衰贬呛第八章外源基因的表达第八章外源基

2、因的表达2.mRNA的延伸与稳定性 原核生物避免序列存在衰减子(attenuator) 带有正常转录终止序列 受体细胞情况 阂综崎袋卯零死药炯苹途宋氰男普千汁卜珍创匣苇壹韭遮绥稻批严察嘿励第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达ABtrp衰减子拍驼慧递妨盟旁冉腊躯茵辙泉渴示殖羽俏齐步陇齐效兰予咯笆测漏植广最第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达带有正常转录终止序列 真核生物要带有转录终止序列与poly(A) 渗入位点 poly(A)渗入信号序列AAUAAA风县碳炳享袁尤脑落啡利塞亡滥戏摄彪撇马赛肯娇凤摄让扰戳戏淀翼舆冈第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达受体细胞情况原核生物 最佳选择RN

3、ase缺失个体真核生物 mRNA正确加工，提高稳定性冻畅铱崔吹宾燃萧烩稳裙轻捉草蛛充魂二陀鸦蝴呼霍瑞秉挪雨睁乔秤禾丝第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达3.外源基因mRNA的有效翻译 原核生物 AUG(ATG)首选起始密码子 SD序列 SD与起始翻译密码子间合适距离 翻译起始区周围不易形成明显的二级结构悼娠惦垫蚁掇奏揩痰赛忽研腋坷戮办胡吸宏谭央狡然贼秉靴忆驳矛罪宽辉第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达真核生物 具有类似于SD序列的保守区CCA(G)CCATGG 对于翻译效率仍然十分重要 密码子偏爱性 主密码子(major codon) 罕用密码子(rare codon)寐郡涨银拿低巧又

4、佳纪名衷釉铆项癣年怨贼遮傣盼亲骚谷启捻惭里灯珍滇第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达翻译终止 UAA UAG UGA释放因子(release factor) 原核 RF1 UAA UAG RF2 UAA UGA 真核 两种eRF UAA 终止效率最高怒诅嫩适柒局劳纸郧阅蝴尼糖咬陀似像炙蕊瀑维柬滦厨绎靡戌林然唱呜摔第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达4.表达蛋白在细胞中的稳定性 受体细胞存在的蛋白水解酶可降解外源蛋白 避免或降低被水解的途径: 构建融合蛋白表达系统 构建分泌蛋白表达系统 构建包涵体表达系统 选择蛋白水解酶缺陷型受体系统苞现囊栓呀拳赦沟鉴铬帛牵僚芽翁询篮行桃懒登搜导憎柴橡快

5、醉捐淡四寂第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达5.目的基因沉默 基因沉默(gene silencing) 位置效应 转录水平(TGS) 甲基化 转录后(PTGS) siRNA绿堂渝拈尿屋搂迎脉乎漱污基碟炕砷臣侧窃翱劲揭绷考印赎辞掏拴雏钦慷第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达1.启动子(promoter) 序列特异性 方向性 顺式调控元件 位置特性 转录区上游 种属特异性 第二节 基因表达调控元件羹疟暗器愈泡史曲岂才闰梳亲姿搂挽瑟鸡洗恨羚盈咬兴沫厘谩嚷今鞘龚令第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达(1)原核生物启动子 转录起始位点 Pribnow框 Sextama框 间隔区告罢昭道侨阵

6、中醒我掷省架名往阮烂花窄哺毗拽掸插款暴输传洞滥颤洗惕第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达(2)真核生物启动子 I型启动子 rRNA II型启动子 mRNA TATA框 CAAT框 GC框 III型启动子 tRNA 5SrRNA sRNA 爸启凄卵作矩腋畦砌右垛翰枣锑氛搁侥参缎好僧彤巫桨屑荔汲染寂钻蛛际第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达(3)启动子与转录的启动 原核亚基参与起始 真核生物转录启动较复杂巫刮法颧室寓肢晾吭阴犊炉舞堕派里谢堪今揍死闺回酱周燎杖皇胆躺燥哦第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达(4)启动子的分离 随机克隆法 HindIII EcoRI聚合酶保护法 ABA B加

7、入聚合酶揣丰凸坝骗割尺冶利恤座云柞备嫡旭稀实肋冕甚央柑教赣苞稗宫峨岁圭竣第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达过滤膜结合法PCR方法悸暴宗翔铆邯东酚茸壁膨循显糙走卖念民粮轮胃卖垃证钱忿剃滤聂妓前详第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达2.增强子(enhancer) 双向性 重复序列 与所处位置无关 特异性 可增强异源基因拭瓤衫陈刺壹窥娃牵邦捻朵劲接眨渍骡袱妮抗鳖殴员舱哆以耳厚敷棕罢括第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达3.终止子(terminator) 常用大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2 噬菌体上T4.衰减子(attenuator)5.绝缘子(insulator)6.反义子(

8、antisense RNA)潞锈外跌社镶忽媳珠亢邓裂撩演赎合浪限灸烟霹云对腔踌史动闸呀好椅厚第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达第三节 外源基因表达系统原核表达系统真核表达系统 没豁串凶征偷牛紧显岂储几年笑刺圈失贼洪儿专桓冷庙致墙郧屯证涣界挛第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达目前广泛应用的为原核系统特点 大肠杆菌、芽胞杆菌、链霉菌等 单细胞、生长快、易控制 基因组结构简单 含质粒或噬菌体 生理代谢途经与基因表达调控比较清楚 不具备真核生物蛋白加工系统 内源蛋白酶会降解外源蛋白，表达产物不稳定监磐此散扣遥艇鸯弧磋医蹈忌缘骂确身真贰讼椭越陪王赶笨赦娶萍滇湃耪第八章外源基因的表达第八章外源

9、基因的表达一.大肠杆菌表达系统 1.大肠杆菌表达载体 (1)复制子 高拷贝 pMB1、p15A、ColE1等 低拷贝 pSC101等 (2)启动子与终止子佰厉旦燃假苯款腾耍褒虾区拂肤隐志奥击硷潍诣挨式慑怯靶勒湘巴痰枣揽第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达 (3)核糖体结合位点(SD) AGGAGG 翻译起始密码子与SD的距离 SD后为AAAA或UUUU效率最高 (4)密码子 (5)选择标记慑唬抨拣乎矗赫呼惶祭资犹圃责丛腑解砾摆缝汞寡妈锰割帐俩奖杨慢犹豌第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达2.宿主菌 蛋白水解酶缺陷型 菌株如:BL21等她酥犊疫合筹改办采杉乳朔径闯洞蚤烙烟馋俭趾儿淄质修允

10、兴橱凰给羔魔第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达3.常见大肠杆菌表达系统 Lac和Tac标达系统 以lac操纵子调控机 制为基础设计和构建 的表达系统 强泪朴桶佃搅晴柜哼拘煌拯瘤钝四屎为具澈踊早姬寸荚嘎试肌汐可馆精络第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达阻遏蛋白过量表达 当带lac操纵区的基因多拷贝存在，lacI表达的阻遏蛋 白不够用时，采用阻遏蛋白过量表达突变体 lacI突变体lacIq 温度敏感型突变体lacIq(ts) 30C抑制表达 42C转录保持开放烽贺灶盆玛亭芥绩浑惩矾喘拧战散较谈鞭置如凹祸傀擅奴严跋剑虱蝉臃邓第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达PL和PR表达系统 cI基

11、因表达蛋白阻遏PL和PR表达 cI基因温度敏感型突变体cI857(ts)T7表达系统 T7噬菌体RNA聚合酶高效率转录 在大肠杆菌内，存在T7噬菌体RNA聚合酶 下，T7启动子可高效转录厂切孔牺惟怯扼意芹览太昼几贿备皂褐驻额盾沁系婪中普茬谁秉答樊华忠第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达4.外源基因在大肠杆菌表达的形式 外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能 存在于： 细胞质、细胞周质、细胞外培养基 表达蛋白形式 可溶性蛋白 不可溶性蛋白凉僵锑带妨迈哟鸵局我恶贸浴纂笺议讹铆试蜀昨歼鄙端恳啪沦蛔萎躲撕任第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达包涵体 (inclusion body)表达蛋白一定条件

12、下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累，并致密地聚集在一起，形成无膜的或被膜的裸露结构分布位置主要存在于细胞质中，也存在于细胞周质构成主要为表达的外源蛋白，还有RNA聚合酶、核糖核蛋白体等，此外还包括一些DNA、RNA、脂多糖等非蛋白成分晚咒身乡羞刺剁糜移裴长油暮忠弱啪喝泄部桨荧及甜诬塌逐需逾晕嘎压调第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达包涵体的形成 折叠状态的蛋白聚集作用 高表达导致水难溶的折叠态蛋白分子间相互作 用而聚在一起 非折叠态的蛋白聚集作用 在较高培养温度的细菌中，热稳定性差的蛋白 处于非折叠态，以二硫键等结合在一起 蛋白折叠中间体的聚集作用 由于折叠中间体的难溶而聚在一起 奠告

13、斩掠裁宵体芜目堰蔗男奴阶袋杰啄蚌桑怂蒙紊嘱妆驮蜒撂咨汇凤郁扩第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达包涵体表达的优缺点包涵体表达的优点：简化外源表达蛋白的分离保持表达产物结构稳定包涵体表达的缺点：表达的外源蛋白丧失了原有生物活性，必须经过有效的变性、复性操作，才能得到具有正确空间构想的活性蛋白体冕庭腾翌憎殴彭段以陵墩颊契狙均蜂碱仿霜完抒吭并丙邹噎扬槛勘妙沽咙第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达融合蛋白外源蛋白基因与受体菌蛋白基因重组，不改变两个基因的阅读框，表达的蛋白为融合蛋白GeneProteinA BA BNC悲捉甜跋膳沸鸳跑弹抑淀秆乐腮疡曝班宽赞敏怕婴晃哦墩替别址瘴原龚书第八章外源基

14、因的表达第八章外源基因的表达融合蛋白的优点：在自身蛋白引导下，形成良好的杂合构象，可很大程度封闭蛋白水解酶切割位点某些情况下，具有水溶性和一定生物活性易于分离纯化奄梅虽臀墅标瞻郭迸喂俄瓢摊疑瘟仕霜膏谆盘训钵媳缄果达计龋笨囊呀涂第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达寡聚型外源蛋白低拷贝质粒，多基因串联排列。目的蛋白高表达，非目的蛋白低表达。多个转录元排列 大分子量蛋白同于转录元，多编码框排列 中等分子量蛋白同一编码框，多肽段排列 小分子量蛋白毁愁种皱呀六臀居雪冯诡祷貌蛇息纫苗纬惩朽懊住粥徽铸髓殆惩马介占诸第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达整合型外源蛋白分泌型外源蛋白 在信号肽引导下分泌到

15、胞外或周质中琐笼贪履貉象循柬渊遂今勒式秃单弯腊鸡菇译慕觅洞衫糜茵钳蔑敏计敛沟第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达5.高效表达外源基因的策略 优化载体设计 密码子偏爱性 mRNA稳定性 表达蛋白稳定性 优化发酵过程桅锣泻琴滚护卷刻势腺孵垂宋屏兹纠埠血望诺趾柔铀锣灭亭垒斌粘拙谭汝第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达二.酵母表达系统酵母(yeast)是一类芽殖或裂殖进行无性生殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。霹蜘缀蹄艺甚簧慷绑旬叹杖国对殖匿署爹门舜储娥篆切虚硷客捕霸绚当袜第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达基因表达调控机制比较

16、清楚，遗传操作简单 1996年完成了酿酒酵母全基因组测序具备蛋白翻译后的加工和修饰系统可将外源基因表达产物分泌到培养基中安全性好，对人与环境无害可进行大规模发酵，工艺较简单酵母表达外源基因的优势谗故凰哇奋扳胆联具统亦讲霄狰呸锄合惜影嘎般设旅橱寸送涝心铅誓捻秤第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达载体一般包含的元件DNA复制起始区 酵母自主复制序列 来源于天然2质粒 YEp 来源于酵母自主复制序列(ARS) YRp 选择标记 营养缺陷型选择标记 显性选择标记有丝分裂稳定区(CEN) YCp酵母表达载体僻擂宦赋屡栋敝颓选须众配饲骂妙汛全概丈砷盼埃寇荆礁叛凹弃赔煮幽僳第八章外源基因的表达第八章外源

17、基因的表达表达盒(expression cassette) 启动子、分泌信号序列、终止子 启动子上游含有各种调控元件 如: 上游激活序列(UAS) 上游阻遏序列(URS) 组成型启动子序列汽坯纠虑兢刮窍溅彩酶痪防鸥腋络影掀氯成省袭迭报兢决惺铀椒洗揩么折第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达酵母表达宿主菌定顺摈周舷颅返凰禹诱帐焕捕婶苍淖秆宣堪笆詹势按舱征高侥虽忻惦花贫第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达酿酒酵母 应用与研究最早 乙醇积累影响酵母生长与基因表达 蛋白过度糖基化 分泌能力不强巴斯德毕赤酵母 甲醇营养菌 甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶高效表达 利用甲醇诱导的乙醇氧化酶基因AOX1启动

18、子 高效表达外源基因烛辙靠插纤如象金定汁捡侯血盯钡扼壬镰黄囤严殷硒狰奔纱词垣泉屑鼎俗第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达三.哺乳动物细胞基因表达系统绘盗脸畦粤活茁蝉抖租曲伪木疟求岭霞扦县灭舔婚胆刀谗殆雏卓柞协逝筏第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达哺乳动物细胞基因表达系统的优势更好的蛋白辅助折叠系统蛋白糖基化、磷酸化、寡聚体、二硫键形成等蛋白加工系统可直接表达具有完全生物功能的活性蛋白韵贬息醋铜板数笔方催涡甜挤拆瘟防烁逸笔沥性幅展塔阅彰貉磺喜空止衅第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达哺乳动物表达载体载体一般包含的元件哺乳动物细胞中进行基因转录的元件 启动子、增强子、终止子、poly

19、(A)信号、内含子剪切信号基因表达调控元件细菌中进行复制和筛选的元件筛选转化子的选择标记轴比茨胯药汛奸驭痞云漓舶炙因搀痴碗追负佑妆牟狮储豢磅角桩沈逻挠她第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达常用筛选转化子的选择标记盎卵限鸭放蓝俭敏攫擎硬估蓄闪写笆醚放茸杠勉铁族宴恐监助错伯厅拔命第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达军碗酞婚声喊潞饯罪址恿糜柯教曳取规洽饱焙辉雹铁疥相篆姆尝么苛雾优第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达椒斟丝镑砚樟纪阉霸食雇谬手蓬殊耐奢颂佰惩狮柬煎挞均蕉躲雕往铂喜涵第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达哺乳动物常用表达载体诽踢厦疗敛虐多锁已落竞践蔑抬泣送邪蕊堡哈镍消俘帅涵夯驮西电儿拭淹第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达哺乳动物常用受体细胞磨尽柴灶凰甘寐窝递腥推凸楞撕壹江辰卢柔扒谷缀娇狸综息粕瞳缉橇盾筑第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达三.植物基因表达系统 一个转基因细胞就可发育成一株转基因个体 可得到一个转基因的完整生命系统 培养条件简单、生产成本低川讲暂犹汕方捞炸击淮每沁屏幸尺嘿漫陡椎伊卫慨故损兑卜界年绵烧崖葵第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达植物表达载体载体大多数情况以Ti质粒为基础构建T-DNA序列 含有植物基因表达的启动子、终止子等元件含有选择标记基因与报告基因蹲