不同细胞基质狂犬病疫苗的优缺点探讨-课件

1、不同细胞基质培养狂犬病疫苗优缺点探讨中国药品生物制品检定所董关木内容 一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、二倍体细胞培养疫苗 2、原代细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白 2、抗生素 3、明胶 4、牛血清 5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容 一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、原代细胞培养疫苗 2、二倍体细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白 2、抗生素 3、明胶 4、牛血清 5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例Ra

2、bies vaccines HistoryFenje et al原代地鼠肾细胞疫苗Wiktor et al人二倍体细胞培养疫苗Kondo et al鸡胚细胞培养疫苗Montagnon et alVero传代细胞培养疫苗David Semple成年羊脑组织疫苗Fuenzalida et al乳鼠脑组织疫苗Powel et al鸭胚疫苗1885191119551960196419651985我国目前人用狂犬病疫苗 一、我国生产的狂犬病疫苗 1、地鼠肾原代细胞纯化疫苗aG株 2、Vero细胞纯化疫苗aG株 3、Vero细胞纯化疫苗CTN株 4、Vero细胞纯化疫苗PM株 二、进口疫苗 1、法国Ver

3、o细胞纯化疫苗PM株 2、德国鸡胚细胞纯化疫苗Flury-LEP 中国药品生物制品检定所细胞培养疫苗的推进80年代由于细胞培养疫苗价格昂贵，仅在美国、欧洲和加拿大使用，各种疫苗的比率细胞培养疫苗7羊脑疫苗占64乳鼠脑疫苗占292004年WHO强烈推荐，停止使用脑组织疫苗，至今非洲、南美使用脑组织疫苗。中国1980年代已实现了细胞培养疫苗内容 一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、原代细胞培养疫苗 2、二倍体细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白 2、抗生素 3、明胶 4、牛血清 5、防腐剂四、暴露后处理的失败

4、案例原代细胞 原代细胞最初来源于供体的正常组织细胞后在体外的首次培养的细胞，在适宜的培养条件下细胞可以基本不改变性状而获得可以连续传代的特性，但不能无限期分裂繁殖，为有限生命，没有肿瘤原性。原代细胞的种类和生产的疫苗 鸡胚细胞 地鼠肾细胞原代狗肾细胞原代猴肾细胞原代兔肾细胞原代牛肾细胞狂犬病疫苗 麻疹疫苗 狂犬病疫苗、 乙型脑炎、森林脑炎、肾综合征出血热狂犬病疫苗 小儿麻痹疫苗风疹疫苗轮状病毒疫苗地鼠肾原代细胞培养生产狂犬病疫苗病毒株：aG株，须使用豚鼠脑毒种肾脏粉碎浓缩纯化制备成疫苗1、病毒株中国自行建立，是国际上最早的细胞疫苗之一。2、经历了淡苗、浓缩苗和目前的纯化疫苗三个阶段。3、病毒株

5、传代过度，免疫原性少差，浓缩倍数高，4、生产用毒种为豚鼠脑，有潜在的脑组织引起的过敏反应,5、灭活剂为甲醛，疫苗中的残留可能引起注射部位疼痛。病毒灭活无菌取肾收获病毒纯化鸡胚细胞疫苗（PCEC）病毒株：Flury-Lep胚胎粉碎接种方案:每次1 ml5次注射 原代鸡胚细胞培养，无致肿瘤潜在风险； 使用SPF鸡胚，无特定病原体，细胞安全性好； SPF鸡蛋成本高，疫苗价格高； 疫苗纯化降低了宿主细胞蛋白，但鸡蛋过敏者仍须慎重使用； 病毒株在鸡胚细胞中产量较低，生产成本较高。 剂量大，每剂量1ml。病毒浓缩纯化SPF鸡胚病毒收获病毒灭活原代细胞优点： 细胞的生物学形状基本与母体一致，染色体核型和 基

6、因基本没有改变，没有致肿瘤的风险缺点： 由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性存在差异； 动物的个体间存在差异，难以保证细胞质量的一致性； 需要建立符合要求的动物繁殖设施，污染环境有悖3R原则 原代细胞培养的营养条件要求较高 不能进行生物反应器现代化大规模培养 外源致病微生物污染的风险较大二倍体细胞疫苗二倍体细胞具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常；在培养条件下，不能无限期的分裂繁殖； 无肿瘤原性，保留原体内细胞特性。 常见的二倍体细胞： WI-38 IMR-90 MRC-5 2BS KMB-17 二倍体细胞代次的计算： 以细胞群体倍增为计算单位，当一瓶细胞长满达到一定数量

7、时， 进行细胞传代使一瓶分种为二瓶，到该二瓶细胞长满分别达到 原来的细胞数量时为一代，如1：4传代即为二代。二倍体细胞疫苗 缺点： 不能无限繁殖， 培养条件要求高， 疫苗生产时病毒产量较低，生产成本较高。 目前不能大规模生物反应器培养 优点： 为正常二倍体细胞，无肿瘤原性， 可建立细胞库 无外源因子污染，质量可高度控制， 生产纯化时无须考虑细胞 DNA 不用大量动物 与人抗原性一致，过敏反应小，安全可靠。 人二倍体细胞狂犬病疫苗 (HDCV)过滤超率灭活纯化稳定 冻干细胞种子批MRC 5 第16 代病毒株PM 1503 - 3 M终产品 1 ml/剂优点 WHO 推荐的狂犬病疫苗 金标准 免疫

8、原性高 PET体现的效价高 安全性高缺点 不可能大规模生产 病毒产量低 生产时间长 需要病毒抗原高度浓缩 复杂的时间控制使生产难度加大 价格昂贵传代细胞传代细胞称细胞系（XXXcell line)，最初来源与正常组织或肿瘤组织，在原代细胞培养成功的基础上进行传代培养，培养条件合适时可以连续传代，在某一传代过程中改变了原来的形态和性状，可以无限期传代，传代细胞系往往具有致肿瘤性用于疫苗生产和研发的传代细胞 Vero BHK CHO等对传代细胞的关注 年代 管理机构 细胞 1954 AF流行病学委员会 猴肾细胞 1967 NIH 考虑使用人二倍体细胞 1978 NIH 考虑肿瘤细胞（如Namalw

9、a 细胞产干扰素） 1984 NIH/FDA DNA、病毒、转化蛋白等DNA10pg/剂 1986 WHO专门研究小组 DNA、病毒、转化蛋白等DNA100pg/剂 1996 WHO ECBS DNA 10ng/剂 1999 FDA NIH WHO IABS DNA风险未能明确 2004 FDA NIH WHO IABS 表述统一一致 2006 WHO 开始修订WHO细胞基质的规程 优点： 传代细胞系，几乎可以取之不竭已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经 建立，细胞质量可高度控制，该细胞生长条件要求不高，容易培养繁殖；可用生物反应器大规模生产大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖疫苗生

10、产是不要动物 缺点： 由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准（10ng/剂）目前不适合活疫苗的生产 传代细胞用于疫苗生产的优缺点 生物反应器大规模细胞悬浮培养生产疫苗细胞库中取种子细胞复苏从方瓶中扩增至转瓶扩增到微载体大罐接种病毒种子 aG株（中国）CTN株（中国）PV株（巴斯德）PM株（巴斯德）多次收获病毒液浓缩，灭活纯化成品疫苗 DNA 病毒性灭活疫苗 关键点3-1 生产工序和/或步骤细 胞毒 种处理动物，选取所用组织清洗组织，剪碎，用自然沉降法清洗加胰酶消化组织培养液分散成细胞培养液，牛血清，抗生素，调节pH分装转瓶培养预留5或至少500ml作对照观

11、察14天或至病毒液收获结束毒种检定无菌试验 浸 泡洗 换清除牛血清抗菌素培 养收获病毒液 可多次病毒滴定无菌试验支原体不同灭活剂、灭活方法、程序浓 缩灭 活膜过滤，截留量大小、倍数灭活验证试验最敏感方法立即取样合 并传代细胞扩增 接种无牛血清培养液传代细胞工作库细胞复苏转下页 病毒性灭活疫苗 关键点3-2 生产工序和/或步骤柱层析 单柱、多柱 区带离心其它方法纯 化无菌试验抗原含量测定蛋白量测定牛清蛋白DNA配 制人白蛋白防腐剂佐剂半成品 成 品抗生素 NO冻 干液 体鉴别试验外观化学 pH 防腐剂 水份 佐剂效力试验热稳定试验无菌试验细菌内毒素或热源异常毒性等无菌试 验分 装当日分装完毕大罐

12、可二天Vero细胞疫苗质 量 标 准： 80年代 美国 FDA 10pg /剂 欧盟、WHO 100pg /剂 我国卫生部 100pg /剂 90年代后期 WHO 推荐为 10ng/剂 2000年版中国生物制品规程10 ng /剂 2005年版中国生物制品规程100 pg /剂 检测灵敏度： 1-10pg/ml 2004年IABS大会的观点： 肿瘤细胞的DNA可以在动物模型或人类引起肿瘤的发生，经多个研究小组的定量风险评并基于各种不同的设定为依据，得出的结论为： 即使生物制品中存在细胞基质DNA 的肿瘤风险是非常低的。Vero 细胞残余DNA的致瘤性中国药品生物制品检定所美国FDA对Vero细

13、胞用于疫苗研制的建议2002年5月20日发表对以Vero细胞为基质的病毒性疫苗研制者的信。CBER的意见认为Vero细胞作为病毒性疫苗的培养用细胞基质是可以行的 /cber/ltr/vero031301.htm. Letter to Sponsors Using Vero Cells as a Cell Substrate for Investigational Vaccines FDA美国FDA的CBER对Vero用于疫苗研制的建议Vero细胞生产的产品须无完整的Vero细胞虽然WHO目前已接受注射用传代细胞产品DNA残余量不超过 10ng/剂。 CBER建议须继续关注产品中Vero细胞残余

14、DNA的量。 残余Vero细胞DNA的风险水平应按不同情况不同处理，要考虑疫苗的给药方法，如注射、粘膜或其他途径。 因此CBER建议： 要确定终产品中残余细胞DNA的量和DNA的大小，应该在疫苗终产品中描述每人用剂量中含残余DNA的量。由于使用了各种不同的处理方法（如DNA酶处理）细胞残余DNA的量和大小可进一步下降，要评价已加入的生产工艺或考虑要加入的生产工艺以其减少DNA，应注意由于改变工艺而引起潜在的产品质量的影响（如免疫原性） 为何对DNA表示担忧 原因 1、细胞可能含有 1) 致肿瘤基因 2) 整合在细胞基因中的病毒基因 2、生产疫苗用的细胞基因会带入疫苗终产品中 3、产品中的DNA

15、通过注射进入使用者体内导致的肿瘤病原体感染 结果 1、感染 2、诱发肿瘤 1）肿瘤基因的表达 2）原癌基因的激活 3）肿瘤抑制基因的关闭（失去功能） 3、突变基因的插入 激活、抑制功能丧失、正负调节功能的破坏 关于原癌基因任何哺乳动物均存在原癌基因，尤其是染色体变异的细胞致癌的风险更大，也是目前关注Vero细胞安全性的焦点。将完整的原癌基因切割，可能使其丧失致癌性。 P53基因是位于17p13.1上，P53的突变与许多癌症相关 它由393个氨基酸组成，核苷酸大于1200bp。 乳腺癌基因(Breast Cancer Gene, BACA)目前至少发现2个 位于17q21， BACA1，基因长度

16、大于100kb 位于13q12.3， BACA2，基因长度大于70kb 白血病人9号染色体上的8.5kb的mRNA是突变基因。 子宫颈癌病因95由人乳头瘤病毒所致，已知E7基因是重 要原因，E7基因由300多个核苷酸组成。细胞培养狂犬病疫苗质量标准 检定项目 质量标准 半成 品配 制前 原液残余牛血清蛋白含量 (ng / 剂) 50抗原含量 (血凝, ELISA) Vero细胞DNA残留100 Pg / 剂地鼠肾鸡胚细胞疫苗不作该项灭活试验脑内注射小鼠20只，观察14天，应全部健存蛋白含量测定 120ug / 剂 成品 检定鉴别试验同效力试验，效力试验不合格时，鉴别试验不成立外观因为白色疏松体

17、，复溶后应为澄明液体，无异物化学检定 PH值7.2 8.0水份（w/w ） 3.0%液体疫苗不作该项硫柳汞含量 (mg/ml) 0.10无菌试验应无细菌生长细菌内毒素 100 EU异常毒性试验 小鼠法小鼠应键在, 体重增加 豚鼠法豚鼠应键在, 体重增加效力实验应2.5IU / 剂热稳定试验37 14天后，效力试验应2.5IU / 剂内容 一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、原代细胞培养疫苗 2、二倍体细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白 2、抗生素 3、明胶 4、牛血清 5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例

18、疫苗的添加剂 人白蛋白是大多数疫苗中添加的保护剂，使疫苗的效力稳定，尤其是液体疫苗。 目前人白蛋白的生产工艺为“低温乙醇法”经不同浓度的乙醇反复沉淀所得，最终产品还须经60 10小时的专项病毒灭活。 经验证该产品有可靠的安全性，国内外至今尚无使用该产品而感染HIV、HBV、HCV等报道。人白蛋白:疫苗的添加剂 是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂，纯化过程中已基本去除，质量标准50 n g/剂 最担心疯牛病（传染性海绵状脑病、T S E） WHO ：人及动物传染性海绵状脑病相关的医用或 其他制品的研讨会报告（1997. 3） Report of a WHO Consultation on

19、 Medicinal and Other Products in Relation to Human and Animal Transmissible Spongiform Encephalitis 牛血清：疯牛病无血清培养基生产的细胞培养疫苗正在研发中疫苗的添加剂 WHO：牛组织及体液的传染性分类 I 类 高度感染 脑脊髓（ 眼） II类 中度感染 脾脏、扁逃体、淋巴结、回肠、近端大 肠、脑脊液、脑垂体、肾上腺、（硬脑 膜、松果体、胎盘） III类 低感染性 周围神经、鼻黏膜、胸腺、骨髓、肝、 肺、胰腺 IV类 无感染性 骨骼肌、心脏、乳腺、牛奶、血清、粪 便、肾脏、甲状腺、唾液腺、唾液、卵

20、 巢、子宫、睾丸、附睾、胎儿组织、初 乳、胆汁、骨骼、软骨组织、结缔组、 毛发、皮肤、尿液。疫苗的添加剂 1、1980年-1996年在英国居住满3个月者 2、1980年-1990年在北欧的军事基地居住满 3个月或在南欧满6个月以上。 3、1980年-目前在法国居住满5年以上 4、自1980年以来接受过输血的人员。 5、自1980年-目前在欧洲居住满5年以上者。 以上人员不能献全血，但可以献血浆，因为 白蛋白的制备过程能去掉海绵状脑病的致病 因子；而英国、法国人两者均不能。 Revised preventive measures to reduce the possible risk of tr

21、ansmission of Creutzfeldt-Jakob(CJD) Disease and Variant Creutzfeldt-Jakob Disease by blood and blood product,Final FDA guidance document, WWW./cber/gdlns/cjdvcjdq&a.htm 人白蛋白 疯牛病 疫苗的添加剂 明胶：国际上趋势：疫苗中尽可能不用明胶冻干疫苗中冻干保护剂使用明胶：动物源性明胶猪源性明胶牛源性明胶 牛皮源性明胶 牛骨源性明胶 绝不能使用头骨和脊髓骨 产生抗明胶IgE抗体，出现较重且多的过敏反应疫苗的添加剂 抗菌素： 在疫苗

22、的生产阶段，有些抗菌素可使用 如卡那酶素、新霉素等，在纯化过程中应尽可能去除。 但不能加青酶素和-内酰胺类。 国外疫苗生产常用新霉素，而中国均使用卡那霉素、 庆大霉素。临床上新霉素常用于外用，而卡那霉素、 庆大霉素常用于肌肉和静脉注射。 疫苗中使用新霉素引起过敏反应的风险要小于卡那、 庆大霉素 防腐剂 硫柳汞(无机汞）： 常用浓度0.01% ， 易溶于水。 作用： 对革兰氏阳性、阴性的球菌、杆菌的抑菌能力均很强。 原理： 重金属离子与菌体中酶蛋白的巯基（-SH）结合使酶失去活性，硫 柳汞对菌体、病毒和血清蛋白的损害很弱。 使用范围： 目前我国的液体疫苗均添加硫柳汞作为防腐剂。 其他防腐剂： 氯

23、仿、硝酸汞苯、石炭酸等但疫苗一般不使用。 趋势： 不使用防腐剂，在完全达到GMP要求的100级条件下生产不应有细 菌生长，只有多人份分装时不能一次用毕的疫苗才加防腐剂。 担忧： 可能引起注射局部红肿等不良反应 可能对6个月内婴儿产生体内蓄积（脑中） WHO意见：含硫柳汞疫苗的危险并未得到证实，没有任何理由需要担忧含硫 柳汞疫苗的安全性，因此也不必改变现有的免疫接种活动。 /vaccine_safety/topics/thiomersal/questions/en/index.html 病毒性灭活疫苗 内容 一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗 1、二倍体细胞培

24、养疫苗 2、原代细胞培养疫苗 3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题 1、人白蛋白 2、抗生素 3、明胶 4、牛血清 5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例 Henry Wilde， Failures of post-exposure rabies Prophylaxis , Vaccine, 2007(25): 7605-760972岁泰国老妪,颈部被犬咬伤,伤口处理及时正确,并注射了法国产马抗血清,剩余部分注射三角肌,PVRV 0、3、7、14注射，14天时增加PCEC疫苗 第20天发病死亡。泰国9岁男孩被犬咬伤鼻子和颈部，伤口处理及时正确并浸润注射法国ERIG，剩余部分注射大腿肌肉；0、3、7、14天三角肌注射印度产PCEC疫苗，30天时发病死亡；泰国7岁男孩，被犬咬伤手臂、腿、躯干和背部，伤口处理及时，将法国产ERIG 按40IU/kg以1：1稀释后全部伤口注射，同时肌肉注射Verorab，三天后按皮内法注射疫苗，第20天发病死亡；南非57岁男性，被猫鼬咬伤手指和手腕，伤口及时正确处理，包括次氯酸消毒，HIRG伤口注射，剩余部分三角肌注射，HDCV疫苗免疫，但14天发病出现症状，30天死于狂犬病；菲律宾4岁女孩，被犬咬裂肩部和背部，伤口处理正确及时，法国ERIG 1：2稀释注射全部伤口后等待数小时