DNA复制、修复与重组-PPT课件

1、分子生物学第三章 DNA复制、修复与重组分子生物学遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson & Crick: 一种遗传物质，必须能行使两种 功能，即自我复制和对细胞的高 度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制 控制性状的表达分子生物学DNA的生物学功能储存遗传信息复制遗传信息表达遗传信息产生可遗传的变异 分子生物学亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以 每单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完 全相同的子代DNA分子的过程。 Replicon; Replisome; A unit of the genome

2、 in which DNA contain a region from origin to terminator The multi protein (30) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA 第一节 DNA复制分子生物学DNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs500-5000 bp/min G112hs

3、分子生物学 复制机理的复杂性 D.S. DNAS.S. DNA 能量的供求构型的变化超螺旋线状，开环状多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制的准确性（修复，校正）研究试材的特殊性（温度敏感型ts，突变抑制体系Su）DNA复制速度(E.coli 105 bp/min ，高速解旋 112 km/h)缺乏统一的模式(D.S. DNA, S.S. DNA, Linear DNA.) 分子生物学1. 复制起点与方向（replication origin & direction ） 分子生物学 rich AT & palindrome Enzymes binding site

4、300 bp in replication origin of ProkaryoteAT rich复制起点的特征分子生物学 “呼吸现象” DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生， 导致两条DNA链不断解链与聚合， 形成瞬间的单泡状结构的过程。 在富含AT的区域内尤为明显分子生物学 复制的多模式 单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向分子生物学 子链DNA延伸方向 DNA polymerase reacts on the 3 end only5 OHT C AT C A C 5 OH 3New DNA elongation from 5 to 3 direction ppp OH

5、C+ ppi 分子生物学如果DNA的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 分子生物学A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp因能量的需要， DNA的5 端必须带有PPP游离dNTP具有pppppp OH 3 A T C G 在0.2M Nacl 的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5端，而且 双链DNA的5端碱基配对困难 需要其他机制以解脱 分子生物学碱基发生错配后的校正 费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗 A T C G ppp OH+ pp

6、pAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 分子生物学 2. DNA的半保留复制 （Semi-Conservation Replication） 分子生物学1958 Meselson-stahl(CsCl gradient centrifuge) S generations 0 1.0 2.0 3.0 4.0 0 + 2.0 0 + 4.0 N15 N14 DNASemi-ConservationReplication分子生物学3. DNA半不连续复制 （semi-discontinuous replication） 分子生物学3535OK !How ?5353分子

7、生物学At least one strand of DNA replication in Okazaki fragment 1kbDNA replication in Okazaki fragment 1kb5353（semi-discontinuous replication ! ） Okazaki fragment 1968 Reiji Okazaki分子生物学DNA复制的酶学 DNA复制是一个非常复杂的酶学过程，它需要30种以上的酶和蛋白质，人们常把这些酶和蛋白质称为复制体系，其中一部分酶和蛋白质结合在一起，协同动作，构成所谓复制体（replisome）。分子生物学DNA聚合反应与聚合酶

8、 参与DNA聚合反应的有三种酶：Pol I，Pol II和Pol III， 以四种核苷5-三磷酸，即dATP、dGTP、dTTP和dCTP为前体合成聚核苷酸。Pol II的具体作用还不清楚，根据实验室工作，它在复制过程中似乎没有什么作用，Pol III极其复杂，是大肠杆菌中是主要的聚合酶。 分子生物学DNA聚合酶活性： 在有引物和模板的情况下，Pol I和Pol III都具有DNA聚合酶活性，但Pol I的聚合酶活性主要用于DNA的修复和RNA引物的替换，而Pol III才是使DNA链延长的主要聚合酶。 外切核酸酶活性：35 ：校对、保真53 ： Pol III只作用于单链缺口填充能力Pol

9、III只能填充几个碱基的小缺口Pol I可以填充很大的缺口分子生物学其他酶类DNA连接酶螺旋酶DNA旋转酶分子生物学DNA复制的基本过程 分子生物学DNA复制的基本过程起始链延伸复制终止真正的酶促机理和新DNA分子合成的步骤是十分复杂的，需要多种特异性酶和蛋白因子的参与，涉及蛋白质、DNA和RNA等生物大分子之间的相互作用。 分子生物学1. DNA复制的起始 DNA复制起始部位的序列特征 DNA复制都是在特定起始部位(Ori)开始。大多数原核生物基因组和细菌质粒只有一个Ori位点，真核生物染色体中有多个Ori。由一个复制起始点构成的DNA复制单位称为复制子。原核生物染色体和质粒都是独立的复制子

10、，真核细胞染色体中会有许多复制子。每个复制子在一个细胞周期中都必须起动而且只能起动一次。 分子生物学复制起点（origin）一般指的是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌体、细菌染色体、质粒和一些动物病毒的DNA通常具有明显的复制起点。酵母也有特异的复制起点，在细胞周期S期染色体复制时起重要的作用。在真核生物中，复制起点很复杂，迄今仍难于在分子水平上阐明其特征。分子生物学E.coli、酵母和SV40的复制起始位点的一些共同特征复制起始位点中有多个独特的短重复序列。这些短重复序列被多亚基的复制起始位点结合蛋白识别，这些蛋白对于复制酶在复制起始位点的组装起关键作用。复制起始位点附近一般都有

11、富含AT的序列，以利于DNA双链的解旋，产生DNA复制模板。 分子生物学复制起始位点共同的作用结合多种蛋白，并有助于它们之间的相互作用，从而有效地起始DNA的复制。复制起始位点可以决定基因组在S期复制的时间顺序。复制起始位点可以防止DNA复制干扰基因在S期的转录。 分子生物学参与复制起始的蛋白质SSBT抗原ORC、MCMp、Cdc45分子生物学引发 DNA复制的起始就是引物的合成 目前已知的DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链。研究发现，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，提供3-OH，再由DNA聚合酶从RNA引物3端开始合成新的DNA

12、链。 分子生物学前导链的引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。对于滞后链来说，引发过程就十分复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用，还牵涉到冈崎片段的形成和连接。 分子生物学 DNA复制的转录激活 (transcriptional activation） RNA polymerase Rif S 10 Nt RNA primer for leading Strand origin dnaGprimase Rif R for lagging Strand 分子生物学 RNA polymerase Primase (dnaG) (for primer of L

13、eading Strand) (for primer of Lagging Strand) Rif S Rif R 合成的RNA分子与 合成的非典型的mRNA分子与 DNA模板分离 DNA模板以氢键连接不分离 可以使D.S. DNA解链为单链 只能利用单链状态的DNA 状态完成DNA复制的转录激活 为模板合成12Nt的RNA引物 (也可利用 dNt合成DNA引物 ) leading strand引物的合成是否 primase单独存在时没有活性 -由RNA polymerase完成转录 只有与相关蛋白(dnaB.C)结合成 激活合成的 RNA分子作为引物 复合体引发体（primosome) -或

14、由primase (dnaG) 接替 在某种意义上讲, 合成的引物 primase译为引物酶？引发酶！ 仍无定论 ！ 更为确切 ！ 分子生物学primosome Synthesis of progeny strand in lagging DNA pppRNA as primerDNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase分子生物学 RNApol (RNA polymerase) Rif S dnaG (primase) Rif R 完成对后随链引物的合成 完成10 NtRNA引物合成后. DNApolII进行DN

15、A链的延伸 DNApol I 对后随链的RNA引物切除并聚合填补 连接酶 (ligase）将 Okazaki 片段连接 完成对先导链引物的合成 实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断 Conclusion 分子生物学2. DNA链的延伸 引发一旦完成，DNA聚合酶就在RNA引物的3-OH端按照模板链的碱基顺序，以碱基互补的规则延伸DNA链。无论原核还是真核生物，前导链是按53方向连续合成，后随链的延伸也是按53，但不是连续合成，而是先合成多个RNA引物，再延伸为多个冈崎片段，最后连接起来。 分子生物学原核/真核生物DNA链延伸的不同 主要是催化的酶不同E.coli

16、前导链和后随链的合成都是由DNApol III催化。SV40前导链和后随链的合成是由二个不同的DNA聚合酶催化完成的(DNApol向DNApol) 分子生物学3. DNA复制的终止 一般说来，链的终止不需要特定的信号，也不需要特殊的蛋白质参与。但是，环状或线性DNA复制终止的机制却有所不同。 分子生物学环状DNA复制终止环状DNA复制时，可在离起始点180。相遇，即两个复制叉同时到达一个部位。有些环状DNA分子内含有终止位点，一个复制叉先到达该处停下来，然后另一个复制叉也到达该部位。如在正常情况下，DNA复制时终止点与起始点相差180。如果删去一些非必需区域，或者插入一些无关的片段从而改变了复

17、制起始点和终止点的相对距离，经改造后的DNA复制终止点仍保持与起始点相差180。表明DNA分子没有特定的终止点。 分子生物学线状 DNA的复制终止 及避免5末端短缩的模式 （5-end shortend ） 分子生物学 3-OH ? 3-OHLagging strand of circle DNA replication Lagging strand of linear DNA replication But 35533-OH ? 分子生物学T7 phage Direct repeat in the end of linear DNA Concatermer between two offsp

18、ring DNA after replication (100 dNt terminal redundancy)分子生物学?Concatermer（二联体） 3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OH分子生物学Replication of linear Adnovirus-2 DNA 35937 bp pTP C G IR 103-162 IR ; including 50 bp replication origin rich AT & 1th C/G high conservation pTP ; pre-Terminal protein 80 kd TP 55 kdDBP; S.S.

19、 DNA binding protein 72 kd Ad2 DNA polymerase ; 140 kd 分子生物学复制起始复合体 引发复制 （不需引物） 避免5-end shortent pTp-Ser-dCMP CG 过程 SSB + ATP DNA 末端解链 TP pTP-Ser + dCTP pTP-Ser-dCMP 3 OH分子生物学IRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplaced S.S DNA Hairpin PanhandlepTP-Ser-dCMPG 3G 3G 3TP分子生物学真核生物染色体 DNA末端补齐模式 端粒的发现 1938 Muller X-r

20、ay Drosophila 末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomer 1938 B.McClintock 顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。 推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s 分子生物学发展 端粒研究获得突破分子生物学 端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (rich G chain) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (rich C chain) 1985. Carol Greider & Blackburn,

21、 1986. Gottchling 尖毛虫 telomer binding protein 1 55kd telomer binding protein 2 26 kd四膜虫 telomerase 将T2G4 末端重复延伸 游扑虫 Telomerase = RNA CAAAACCCC 链 + 末端结合蛋白 （TBP） + 100 bp telomer 分子生物学 model TBP is Reverse transcriptase-like RNA complement with 3 end of DNA & as template for cDNA Elongated T2G4 3-end

22、as primer for 5-end DNA synthesis G链 T2G4-TTGGGGT TGGG C链-A2C4- telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 TTG分子生物学 telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 G链 T2G4-TTGGGGT TGGG C链-A2C4-TTG telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 GGGTTGG链 T2G4-TTGGGGT TGGG C链-A2C4-TTGGGGTTG- telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 telomerase 3 CCAACCC

23、CAACCCC- 5 telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 When G-rich strand is longer enough telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 分子生物学 G G hoogsteen bond Tetraplex helix G链 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C链-A2C4- G链 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC链-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACC

24、CDNA polor分子生物学Telomerase activity is repressed in somatic cells of multicelluar organisms resulting in a gradual shortening of the chromosome with each cell generation. As this shortening reaches informational DNA, the cells senesce and die. 细胞分裂端粒阈值分子生物学细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂端粒阈值端粒长短端粒酶活 Harley (1989)

25、端粒的重复片段为探针检测 胎儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株老年细胞株年龄小 大端粒长度 长 短早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老研究端粒（记时器）丢失的速率/ 年，预测人类的寿命 XX XY why?PCD机制、癌细胞的无限繁殖分子生物学DNA 复 制 的 调 控 分子生物学噬菌体DNA的复制调控 噬菌体和原噬菌体 原噬菌体基因组整合在宿主染色体中，不能自主复制，依赖于宿主染色体进行复制，而且噬菌体基因表达被阻遏。分子生物学几个概念噬菌体感染大肠杆菌以后。可将其基因组整合到细菌染色体上，并成为细菌基因组的部分，随着染色体DNA的复制而复制。这种整合有噬菌体基因组的细菌称为溶原细菌，这

26、一过程称为溶原途径。溶原性细菌般不被同种噬菌体再行感染，这一现象称为免疫性。噬菌体感染宿主后也可以不通过溶原途径而利用细菌细胞内的成分进行繁殖，最终使宿主裂解而死亡，这一过程称为裂解循环，也称溶菌途径。溶原性细菌受某些外界物理或化学因素（如紫外线、丝裂霉素C等）的作用，原噬菌体可以脱离细菌染色体而进行自主复制，最终导致细菌裂解，游离出大量噬菌体，这一过程称为诱导。 分子生物学噬菌体的生活史分子生物学溶源性和裂解性的存活方式可以相互转化。分子生物学分子生物学 噬菌体的lysogenic和lytic两个生活史周期的发育过程是cI、cro、N、Q、cII/cIII等6个基因的控制下进行的。分子生物学

27、大肠杆菌DNA复制的调控 高度保守的复制起点oriCA/T含量56；碱基序列高度保守，某些部分种类不十分保守，但数目却是保守的；有914个GATC位点，GATC位点中腺嘌呤的甲基化对于oriC的功能不可缺少；有四个高度保守的DnaA识别位点；oriC中没有大于20个密码子的开放阅读框。 分子生物学oriC质粒复制可分为6个阶段： 转录活化及oriCDnaA蛋白起始复合物的形成；DnaB、DnaC等蛋白相互作用形成前引物复合体；SSB与解旋酶参与复制，使双链DNA广泛解链并形成前引物合成复合物；由引发酶合成引物，完成复制起始；由DNA聚合酶III全酶在模板引物复合物的引物3末端延伸DNA链；由D

28、NA聚合酶I、RnaseH和连接酶完成5末端的修饰并连接为完整的DNA链，最后由促旋酶形成负超螺旋结构分子生物学ColE1质粒DNA复制调控分子生物学 Repressor model Antisense RNA model RNA-2 positive control 0-555 0 RNA-2 RnaseHOH RNA-2DNA / RNA primer for DNA replication Negative control分子生物学RNA-1110 bp RNase H 不能识别RNA-2, 不能形成primer 的3-OH -555 -4450RNA-2RNA-1RNA-2 110 b

29、p D.S. RNA分子生物学RNA-1 0 When RNA-2200-360Nt Rom gene expression RNA-1 / RNA-2 D.S. repression RNA-1 / RNA-2 不能形成primer的 3-OH 促进 限制 63 aa ROP(Rom protein) RNA-2 只能转录到100-220 base, 不能到达“0”原点 不能形成primer 的3-OH0分子生物学真核细胞DNA的复制调控 真核细胞的生活周期： G1：复制预备期 S：复制期 G2：有丝分裂准备期 M：为有丝分裂期DNA复制只发生在S期分子生物学DNA replication

30、at phase S of cell cycle S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs500-5000 bp/min G112hs分子生物学真核细胞中DNA复制3个水平的调控：细胞生活周期水平染色体水平复制调控复制子水平调控分子生物学第二节 DNA修复（DNA repair） 分子生物学DNA：遗传与变异遗传性和变异性的基础都是DNADNA损伤是某些因素作用下，DNA的结构和功能发生改变，阻碍DNA的复制与转录，DNA的这种变化称DNA的损伤，基因突变也是DNA损伤的一种。 分子生物学引起DNA损伤的因素：1、 物理因素：紫外线：产生胸腺嘧啶二聚

31、体电离辐射：引起DNA结构多种程度不同的损伤，这些损伤包括DNA的主链断裂，一条或二条链的断裂，碱基聚合，糖苷键的断裂等，引起大片段损伤或丢失，造成染色体畸变、基因突变、细胞死亡等。2、 化学因素：烷化剂核苷酸类似物亚硝酸盐和亚硝胺代谢产生的活性物质3、 生物因素：DNA病毒和RNA病毒感染、质粒转移、基因重组、转坐子的转位等都可能使DNA发生改变，引起基因突变。 分子生物学突变分类 点突变 DNA分子中单个碱基的改变，一种碱基被另一种碱基取代。同类碱基之间的取代，如A被G，或C被T取代，这类取代称转换。不同类碱基间的取代，如A被T，或C取代，T被A或G取代，这类取代称颠换。插入突变 在DNA

32、的某一位点插入一个或一个以上的碱基。丢失突变 在DNA的某一位点缺失一个或一个以上的碱基。分子生物学突变可能造成的后果 (1) 突变可能使生物更有利于适应环境，这种突变将会保留和遗传，引起生物的进化。(2) 导致生物体的死亡或生命力的明显下降，属致死突变。(3) 不致死，却引起形态和结构的异常，或发生营养缺陷，或出现新的有害特性。(4) 引起细胞的癌变，癌基因和抑癌基因的突变是许多肿瘤发生的原因。(5) 不发生任何变化和影响。 分子生物学基因突变的特征 (1) 突变以一定的机率随机发生;(2) 突变有可逆性;(3) 突变的发生率可被外界因素所加强;(4) 突变是可以遗传的.分子生物学修复 绝大

33、多数的损伤或突变在DNA未复制前就被修复，保持遗传的稳定性。生物体内存在多种修复机制，采用那一种修复机制对损伤的DNA进行修复，取决于DNA损伤的性质。 分子生物学复制过程中的错配修复机制 (= 10-11)DNA mismatch+ - A- -C-DNApol (= 10-8)经第二次校正= 10-11MRSMismatch RepairSystem复制修复 分子生物学1. ung system (尿嘧啶-N-糖苷酶系统)-TAGC-ATCG-TAGC-A CG-U-TAGC-ung-aseGCUAU-TAGC-A CG-Apurinase(内切酶)-TAGC-ADNApolligaseT

34、CG-分子生物学2. Mismatch repair systemDNA polymerase ligase MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mutH, L, S dam genem6A甲基化酶Scanning 新生链中错配碱基识别新生链中非 m6A 的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段分子生物学MCE scanningDNA中的GATC(palindromic seq.) 为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATC seq.3 -C-CTAG-CTAG- 5 5-T-GATC-GATC- 3 3- 5少 梯度 多（m6A）新生

35、链分子生物学MCE scanningendonucleasePolymeraseligaseGATC GATCCTAG CTAGTCGATC GATCCTAG CTAGTGATC GATCCTAG CTAGTA分子生物学phR 471aaDNA的损伤修复1. photo reactivation-TT-AA-TT-AA-TT-AA-TT-AA- Before replication & Error-free 400 nm Blue light & phR gene (photo-reactivation enzyme) 可见光激活分子生物学2. ExisionRepair Before Rep

36、lication Error-freeUvrA, B, C gene Endonucleases Exonuclease DNA pol Ligase切 补 修 复分子生物学E.coli 存活%U.V 计量w.t.UvrA+ RecA+Rec A+ uvr a-rec a- uvr a-Rec-A. gene 以某种方式参与DNA损伤修复3. RecombinativeRepair分子生物学Rupp.Howard-FlandersTT TTAA AATT TTTT TTAA AATT TT变性 E.coli (Rec-A, uvr-6-)D.S. DNAS.S. DNAU.V. 复制提取 变性

37、TT TT TTAA AA AAReplication is forced to skip past TT dimer gap left in newly strand继续复制分子生物学 存在与重组有关的暗修复机制 与Rec-A基因引起的strand transfer有关 TT dimer未被修复，仅表现在后代群体中TT dimer 浓度的稀释 链的非准确转移，导致突变机率的增加 分子生物学 RecombinativeRepair (strand transfer repair)After replication repair Error-proneRecA, DNA polymeraelig

38、ase genes be needed分子生物学4. SOS repairSOS repair in E. coli have to be induced by U.V. High frequency mutation by SOS repair (Error-prone)DNA damaged300 XsignalRecA cleaves LexA SOSUmnC mutation-Before inducing. LexA-p Rec-A,UmuC11genesNeg. repression-U.V.damage DNASignal (S.S. DNA tail or 5Nt S.S.DN

39、A)机制分子生物学RecA-P; 三种功能 DNA 重组活性 与S.S. DNA结合活性 少数蛋白的proteinase活性当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤， 无TT dimer） RecA-p不表现proteinase活性分子生物学当DNA复制受阻/ DNA damaged能量大量消耗细胞内原少量表达的RecA-p与S.S, DNA结合激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA-p降解RecA-p高效表达 300 times upSOS open分子生物学当DNA复制度过难关后SOS repair 是一种error-prone 极强的修复机制是进化中形成的“ 竭尽

40、全力，治病救人” 的措施（正常状态下，SOS是关闭的）RecA-p很快消失LexA gene onSOS off分子生物学突变的形成DNA未经修复经过修复 / 校正 死亡突变率降低倾向差错修复 (重组修复，SOS）避免差错修复(光修复，切补修复)形成突变不形成突变DNA damaged / mispairing物理诱变，化学诱变，自发突变突变是在修复过程中形成的（非准确的修复）第三节 DNA重组自然界的DNA分子均是重组体 变异是生物进化的重要因素之一生物对环境的适应机制自然选择的重要基础重组的本质基因的重排或交换，即2个DNA分子间或一个DNA分子的不同部位间，通过断裂和重接，交换DNA片段

41、从而改变基因的组合和序列。 遗传重组涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流过程，有时又叫做交换。 遗传重组和重组DNA技术不是一回事！遗传重组指发生在生物体内的基因交流；重组DNA技术指在体外人为地将不同源的DNA组合在一起，是我们有目的有计划地改造生物体的一项技术和手段。重组分类：根据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求，分为：同源重组（homologous recombination）位点特异性重组（site-specific recombination）转座作用（transposition）异常重组 1.同源重组DNA同源序列间常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间参与重组的两个

42、DNA片断序列相同或者几乎相同如果是完全相同片断发生的交换称为对称交换，在遗传上是无意义的事件；如果发生交换的片断是序列相近的，这种交换我们称为不对称交换，由于它发生了染色体的变异，有基因的重复和缺失现象产生，是有遗传效益的重组事件。发生同源重组的条件：DNA分子接触；有缺口；RecA蛋白（重组酶） 同源重组的基本特征 涉及同源染色体的同源序列间的联会配对 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂 和错接的生化过程 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生 的重要信号2. 位点特异性重组 两条双螺旋DNA特异位点不需要RecA，但需要相关酶高度保守性（保守重组）attP of p O pattB

43、 of E.coli B O BB O P P O BInt (Integrase)IHF (Integration host factor)Xis (Excisionase)FIS (factor of inversion stimulation)以噬菌体DNA整合为例Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites4 Int-p 3 IHFXis-p P O P-160 -199 -40 0 +40 +80P- GCTTTTTT A TACTAA- pB- GCTTTTTT A TACTAA-

44、 B15 bp of O site homologousSpecific integration sites of INT-p, IHF, Xis-p噬菌体DNA整合的分子机制Int and IHF bind to different sites in attP. The Int recognition sequences in the core region include the sites of cutting.The Int binding sites in the core lie on one face of DNA. The large circles indicate posi

45、tions at which methylation is influenced by Int binding; the large arrows indicate the sites of cutting. Photograph kindly provided by A. Landy.Multiple copies of Int protein may organize attP into an intasome, which initiates site-specific recombination by recognizing attB on free DNA.3. 转座作用Transp

46、osonA DNA sequence able to insert itself at a new location in the genome (without any sequence relationship with the target locus).转座作用DNA的转座，或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。“转座”？不十分准确，在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来的位置上，在新位点出现的是拷贝，因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制。根据转座子复制与否，转座作用可分为:单纯转移复制转移DNA转座现象的一般遗传特点 a) 不依赖 Donor site 与

47、 Target site 间序列的同源性 (非同源重组过程 ，不依赖 recA 酶) b) 转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）c) 某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有 排他性（免疫性）d) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复(DR) e) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应转座模型 (a)转座酶结合转座子末端和新的目的位点； (b)在两条DNA链的特异位点切开，链交换后重新连接； (c)转座子从宿主DNA上完全切离； (d)目的位点复制成双份或； (e)每个转座子的链被拷贝； (f)产生共整合结构； (g)被解离酶分离。 原核生物的转座因子的种类： ISCompos

48、ite transposonTnA family Transposable phage 复制型转座子 (replicating transposable element)a. 插入序列 （ insertion sequence IS ） GATCGTC -GACGATC l 700 2000 base pair （bp）IR IRGATCGTC -GACGATCCTAGCAG-CTGCTAGStem-loop 5 GATCGTC 3 CTAGCAG l IS插入target site后 target sequence repeats directly flanked the IS b. 复合因

49、子 （composite element / composite tansposon） l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子IS ISIS IS L IS R臂 中心区 臂transpositionmutation 复合转座子一旦形成，转座功能受较多因子调控 结构特点 IR IR IR IRIRIR IS10L Tn10 (9.3 kb) IS10R IR IR I

50、R IRDRDR IS1L Tn9(2.5 kb) IS1R 稳定性Excise or DeletionDR型 (Instable)IR型 (Stable)InversionB AA BBAdonorStaggered cutreceptor转座机制replicating transposition in prokaryoteTntargetStrandstransfercopying of Tn & targetTn DR Tn DRDonor receptor cointegrater & resolutionConclusiona) 转座过程是由 Donor 提供 Tn copy 到 t

51、arget site，涉及酶切 、复制、重组的遗传过程b) 转座完成后，在 Tn 两侧出现 target site 序列的正向重复其长度取决于 staggered cutting 的长度c) 转座因子的 IR 序列是转座酶的重要识别位点，与转座，切除有关d) Cointegrater 是转座过程的中间体 (具有两个 Tn 和两个 replicon), 其稳定性依 Tn不同而异，或 resolution 完成转座过程，或共联导致 Tn 和抗性的积累。3.3.2 真核生物的转座因子及转座机制 转座：DNADNA返座：DNARNADNA 类似反转录病毒 真核生物的转座因子的种类 I 型； 转座II

52、型；返座果蝇：Copia酵母：Ty1 Alu family 果蝇：P、FB玉米：Ac/Ds, Spm/dspm, Dt IR, transposase, needed 单纯转移和复制转移机制Both strands of Tn10 are cleaved sequentially, and then the transposon is joined to the nicked target site. Nonreplicative transposition proceeds by breakage and reunion Nonreplicative transposition results when a crossover structure is releas