真核细胞DNA提取和酶切鉴定

1、真核细胞DNA提取和酶切鉴定生化实验内容安排实验室实 验 内 容一实验16：DEAE纤维素离子交换层析二实验17：血清-球蛋白的提纯实验8 ：醋酸纤维素薄膜电泳三实验9 ：聚丙烯酰胺凝胶电泳四实验3 ：测定蛋白质的比色分析法实验12：血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳五实验18：真核基因组DNA的分离提取六实验7 ：酶促反应动力学实验第一轮第二轮：考试（6个实验室）实验本身:实验室规则:时间、穿着、仪器不能乱动、赔偿制度、整洁、卫生。实验报告（如实记录）规范操作（辨认标签）、污染物、毒物、废弃物（酸碱烧伤大量自来水冲洗）规则实验 实验报告要求：题目，组号实验目的实验原理实验操作：如实记录实验结果及结果

2、分析：实事求是讨论或小结：认真分析，仔细思考真核细胞基因组DNA的分离提取及酶切电泳7/23/20225 实验目的1. 掌握人外周血基因组DNA的提取原理、原 则、提取方法和注意事项，熟悉外源基因 的基本制备方法。2. 学习琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理 和技术。基因组DNA提取的操作流程 实验步骤、取0.3ml抗凝全血，加入到1.5ml Eppendorf 离心管中。 抗凝剂 EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂 不宜使用肝素 、加入1ml STMT，充分混匀 使其溶血。STMT （破坏细胞膜)葡萄糖：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作 用而降解。TrisHCl:不含金属离子,与

3、EDTA更能稳定DNA的活性。Triton X-100:非离子去污剂（表面活性剂），直接破裂 血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及 细胞核。MgCl2: 提供Mg2+，稳定DNA。 、10000g离心2min，弃上清。注意离心机的使用 配平 上清丢弃到废液缸，尽量空净。4、用0.4ml生理盐水洗沉淀，10000g 离心2min，弃上清。注意离心机的使用 配平 上清丢弃到废液缸，尽量空净。、加450lNE溶液将沉淀重新悬浮。NENaCL: 50mmol/L EDTA: 1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2.降低细胞膜的稳定性、加50l 10%SDS，迅速混匀;再加50l蛋 白酶K，轻轻摇匀后置5

4、0水浴1h。SDS 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来3. 对RNA、DNA酶有抑制作用4. 与蛋白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物，使蛋白质变性蛋白酶K(或链霉蛋白酶) 广谱蛋白酶，水解蛋白质。能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性。、加入TE饱合酚500l，轻摇2min，10000g离心 1min，将上层水相移至另一新Eppendorf管内。酚能有效地使蛋白质变性；酚不能抑制RNAase的活性；酚能溶解入10一15的水分。、加入酚氯仿异戊醇混合液500l，轻摇 1min，10000g离心1min，将上层水相移至另 一Eppen

5、dorf管内。氯仿也是一种蛋白变性剂，但氯仿的变性作用不如酚。氯仿有助于加速有机相和水相的分离；使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一一种有机溶剂效果好。酚和氯仿两者交替反复抽提，还可克服酚的缺点。、加入氯仿异戊醇混合液500l，轻摇 1min，10000g离心1min，将上层水相移至另 一新Eppendorf管内。（定体积）移上清时要定量，宁少勿多氯仿： 将残留在水相中的酚带走 也可以再次使蛋白变性异戊醇： 降低分子表面张力，减少气泡产生 有助于分层 上层为水相 中间为变性的蛋白 下层为有机相10、向上清中加入1/10体积的NaAc ，并混匀。 再加入2倍体积的冰冻无水乙醇，充分混匀， 于

6、80放置10min。核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，能与钠、钾、镁等很多1价、2价阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用的沉淀剂为1价钠、钾、铵和锂等离子盐类，如醋酸钠、氯化钠等。常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。11、10,000g离心5min，弃上清, 将小 管倒置于滤纸上。室温干燥5min。12、加入20l双蒸水溶解基因组DNA 。基因组DNA 8l10 X 缓冲液 1l EcoR 1l 离心甩一下，37温浴1h。另外剩余的10l留做电泳分析用。酶切体系 酶切注意事项按顺序加样，每加一个样品更换一次tip头一定要将酶加进去加酶的时候一定保证低温，在

7、冰上操作加完后要充分混匀，用离心机“甩”一下再水浴（配平后，随意调时间，将转速调到接近最大值，即刻再调回零）13、1琼脂糖凝胶电泳检测10L 酶切后基因组DNA 2L 10Loading buffer12L基因组DNA 2L 10Loading buffer1TBE 恒压100V 电泳 0.5-1h 实验原理核酸：包括DNA、RNA两种分子。 DNA RNA多呈单链线性分子双链线性分子双链环状分子 真核生物DNA95%存在于细胞核5%存在于细胞器真核生物RNA10%存在于细胞核15%存在于细胞器75%存在于细胞质 分离纯化核酸总的原则应保证核酸一级结构的完整性排除其它分子的污染 完整性的保证尽

8、量简化操作步骤，缩短提取过程减少化学因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解 如机械剪切力、高温防止核酸的生物降解 DNA酶、RNA酶 纯度的保证核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度排除其它核酸分子的污染 从全血中制备基因组DNA首先用去污剂TritonX-100直接破裂红细胞和白细胞膜，使之释放出血红蛋白及细胞核，通过离心分离即可获得白细胞核；用SDS破坏核膜；用EDTA抑制DNase的活性；蛋白酶K将蛋白质降解成小肽或氨基酸，从而使DNA释放入水相中。用酚氯仿抽提除去蛋白质，再用氯仿除去DNA溶液中残存的

9、蛋白质及酚；用无水乙醇沉淀水相中的DNA，即可获得基因组DNA。Concise process：破裂细胞消化蛋白质有机抽提除去蛋白质沉淀水相中的DNA。DNA抽提示意图 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HMolecular scissor 均来自微生物，并据此而进行命名； 识别序列长度常为4 8 核苷酸序列 ; 大部分酶识别序列呈二元旋转对称结构 即回文结构 ; 其切割后的DNA可产生不同的末端。限制酶的特点（类酶） DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海洋植物琼

10、脂中提取来的，为一种聚合链线性分子。 线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比 DNA的空间构型不同，即使分子量相同其迁移率也不相同 Making an Agarose GelCasting trayGel combsPower supplyGel tankCoverElectrical leads Electrophoresis EquipmentGel casting tray & combsThe tray is the actual mold which provides a shape for the gel as it polymerizes. The comb can

11、 make some “wells” in the gel.Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.Preparing the Casting TrayAgaroseAgarose is a linear polymer extracted from seaweed.D-galactose3,

12、6-anhydroL-galactoseAgaroseBuffer SolutionCombine the agarose powder and buffer solution. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer.Agarose is insoluble at room temperature (left).The agarose solution is boiled until clear (right). Microwave for about 1 minute to dissolve th

13、e agarose.Melting the AgaroseAllow the agarose solution to cool slightly (60C) and then carefully pour the melted agarose solution into the casting tray. Push any bubbles away to the side using a disposable tip.Pouring the gelEach of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.

14、When cooled, the agarose polymerizes, forming a flexible gel. It should appear lighter in color when completely cooled (30-45 minutes). Carefully remove the combs and tape. Place the gel in the electrophoresis chamber.buffer Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1

15、 mm. Make sure each well is filled with buffer.Cathode(negative)Anode(positive)wellsDNA Loading Buffer: Bromophenol Blue (for color) Glycerol (for weight)Sle PreparationMix the sles of DNA with the loading buffer (w/ tracking dye). This allows the sles to be seen when loading onto the gel, and incre

16、ases the density of the sles, causing them to sink into the gel wells.Loading the GelCarefully place the pipette tip over a well and gently expel the sle. The sle should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.Place the cover on the electrophoresis chamber, connec

17、ting the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). Running the Gel wells Bromophenol BlueCathode(-)Anode(+)GelAfter the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in

18、the same direction as the DNA.DNA(-)Staining the Gel*CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times. Ethidium bromide(EB) is the special dye of DNA molecules. It binds to DNA and fluoresces under UV light, allowing the visualization of DNA on a Gel. Ethidium bromide c