复旦大学免疫实验ELISA双抗体夹心法检测抗原

1、ELISA双抗体夹心法检测抗原实验时间：实验地点：实验人：1实验目的阐述ELISA （酶联免疫吸附测定）的原理，列举ELISA类型完成ELISA的基本操作学会分析实验结果能根据需要设计相应的ELISAS实验流程2实验原理ELISA：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的 高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。ELISA双抗体夹心法常用于检测抗原。将已知道抗体吸附于固相载体上，加 入待检含相应抗原的标本使之结合反应。然后洗涤，再加入酶标抗体和底物进行 测定。但该方法只适用于检测多价大分子抗原，不适合检测小分子半抗原。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性

2、，酶标记的抗原或抗 体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。通过加入与酶反应的底物后显色，根 据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析，可以间接放 大免疫反应结果。所以说ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的 酶标记。酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否 有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比 例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果，还可通过ELISA检测仪进行 定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使 ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。3实验材料酶标反应板

3、（包被有抗CEA抗体）CEA 标准品（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml）样品1和样品2酶标抗体（酶结合物）底物液A和底物液B （显色剂A和B）终止液洗涤液4实验方法每孔依次加入0、5、10、20、40、80ng/mlCEA标准品、样品1、样品2各 100四1。37C温盒内温育30min。洗涤4次。于吸水纸上拍干。加入酶结合物1001于各孔，轻轻混匀。37C温盒内温育30min。洗涤4次。于吸水纸上拍干。每孔分别加显色剂A和B各一滴，轻轻混匀。37C温盒内避光温育15min。加入终止液1滴，肉眼观察结果并读取OD450、630值。5结果分

4、析5.1实验现象各孔内加入酶标抗体后，溶液变红；分别加入显色液后，溶液变蓝，并且深浅明 显，标准品中抗原含量越小，溶液越浅；加入终止液后，溶液变黄。5.2数据处理：表1：不同样品浓度的OD450和OD630抗原浓度/ng0510204080样品1样品2OD4500.0610.2690.5080.7061.1162.3080.4351.157OD6300.0390.0430.0420.0390.0490.0580.0420.045OD450-OD6300.0220.2260.4660.6671.0671.980.3931.112图1标准品抗原含M (0D顿q。泌标准品抗原含量/呻图1： od45

5、0-od630-抗原含量回归直线图根据回归曲线计算：样品一的抗原浓度为 ll.lOng,误差为：11.10-10.00/10.00 x100%=11.00%样品二的抗原浓度为 41.82ng，误差为：41.82-40.00/40.00 x100%=4.55%5.3误差分析在洗板的时候会在孔内出现气泡，导致后续加入洗涤液的时候量不够但孔内 已经满了，洗涤可能不是很充分，就会抗原与酶联抗体结合复合物增多或者 酶联抗体有残留，而使得最后酶量增多，OD测值偏大，这可能是标准品抗 原含量为1Ong和4Ong的吸光值偏大的主要原因。在加入抗原和二抗的时候加样的时候，会有少量残留在枪头内，残留量有所 差异，这是不可避免的误差。5.4注意事项：在加样的时候要保证加在加样孔里，减少挂壁，可以用两只手支撑着保持加 样的稳定性，避免交叉感染；加样时要及时更换枪头。温育的时候要有塑料纸遮住反应板表面，防止液体挥发或有异物落入板孔而 影响后续抗原抗体结合反应。洗涤的时候，尽量加满洗涤液在孔里，并保证一定的浸泡时间；在甩去液体 的时候，不要翻过来，平移至吸水纸拍干，尽量减少气泡的残留，防止对后