5.7双水相萃取解析课件

1、第七节 双水相萃取萃取新技术之一、概述 双水相萃取（Two-aqueous phase extraction）又称水溶液两相分配技术（Partion of two aqueous phase system）是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。 其特点是能够保留产物的活性，操作可连续化，能耗低，处理容量大。双水相萃取现象最早是1896年由Beijerinck在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的，被称为“聚合物的不相溶性”。20世纪60年代瑞典Lund大学的Albertsson P A及其同事们最先提出双水相萃取技术并做了大量工作。1989年Diamond等推导出生物分子在双水相体系中

2、的分配模型，但尚有局限。由于成本方面的原因，双水相萃取技术上的优势被削弱，真正工业化的例子很少。70年代中期西德的Kula M R和Kroner K H等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取效果。二、双水相体系的形成 典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（DEX），各溶质均为低浓度时，可得到单相匀质液体；当溶质浓度增加时，溶液变得浑浊，静止形成双液层：上层富集PEG，下层富集葡聚糖。 葡聚糖本质上是一种几乎不能形成偶极现象的球形分子，而PEG是一种具有共享电子对的高密度直链聚合物。各个聚合物分子都倾向于在其周围有相同形状、大小和极性的分子，

3、同时，由于不同类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引力，因此聚合物发生分离，形成二个不同的相，这就是所谓的“聚合物不相溶性”。三、双水相系统的重要特征两相的黏度：萃取相在210mPa.s范围内，而发酵液匀浆相在10010000mPa.s 范围内。双水相系统呈现出低的界面张力。四、双水相体系的类型聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羟丙基葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚蔗糖硫酸葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇甲基纤维素羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐聚乙二醇磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、酒石酸钾钠表1 几种典型双水相体系五、双水相萃取的理论基础相平衡关系图1

4、 PEG/DEX体系相图生物大分子在两相中的分配仍服从分配定律。 物质在两相中的分配六、双水相系统中物质分配的影响因素系统聚合物组成系统物化性质盐及缓冲液温度 当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况： 完全混溶性（匀相溶液）； 物理的不相溶性（相分离）； 复杂的凝聚（相分离）。 1、双水相中聚合物组成的影响eg. 离子和非离子型聚合物都可使用在双水相系统的构成上，但当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸引并发生复杂的凝聚。图2 200C聚乙二醇4000/葡聚糖系统双节点曲线， 比较三种不同类型的葡聚糖 虽然葡聚糖T500和水解过的葡聚糖相对分子量在同一数量级，但二者的双

5、节线离得远，这种差别是由于聚合度分布性效应造成的。蛋白质相对分子量葡聚糖组成葡聚糖40葡聚糖70葡聚糖220葡聚糖500葡聚糖2000细胞色素123840.18 0.140.150.170.21牛血清蛋白690000.180.230.310.340.41乳酸脱氢酶1400000.060.050.090.160.10过氧化氢酶2500000.110.230.400.791.15磷酸果糖 激酶8000000.010.010.010.020.03表2 葡聚糖分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响蛋白质相对分子量体系的组成D-500（9%）/P-4000(7.1%)D-500（8%）/P-6000

6、(6%)D-500（8%）/P-20000(6%)D-500（8%）/P-40000(6%)细胞色素123840.170.170.130.12牛血清蛋白690000.520.340.140.11乳酸脱氢酶1400000.130.080.050.03过氧化氢酶2500000.820.380.160.10表3 PEG分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响 由表2、表3可见，蛋白质的分配系数随着葡聚糖相对分子量的增加而增加，随着PEG相对分子量的增加而降低。 葡聚糖也可由其他多糖代替，可得到类似的结果，如右图所示。 图4 200C聚乙二醇/羟丙基淀粉和聚乙二醇/葡聚糖系统的相图2、双水相系统物理化

7、学性质的影响 双水相系统的性质主要取决于下列物理参数：密度（）和两相间密度差、黏度（）和两相间黏度差、表面张力（）。PEG/质量分数%Dextran/质量分数%界面宽度/质量分数%VT/VB/(Kg/m3) /(mPa.s) g/(mPa.s) /(mN/m)6.05.86.21.5184.1430.3*10-26.56.110.51.4323.61000.12*10-28.07.619.81.7644.33.32.0*10-29.08.524.81.9794.43644.1*10-2表4 聚乙二醇4000/葡聚糖PL500系统的物理化学常数eg. PEG-(NH4)2SO4双水相系统萃取糖化

8、酶 (NH4)2SO4浓度固定不变时，增加PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，当PEG400浓度在2527%时，分配系数高达47.3，浓度过高则不利于酶的分配。 PEG400浓度固定为26%时，增加(NH4)2SO4浓度，糖化酶的分配系数也增大。 (NH4)2SO4的最适浓度为16%。酵母菌存在下肺炎克雷氏菌存在下图5 细胞物质浓度对酶分配的影响3、盐和缓冲液的影响 水溶液中存在的离子会影响溶质在两相间的分配。因为阴阳离子的不均匀分配会产生相界面电位，影响蛋白质、核酸等荷电大分子的分配。通常增加盐浓度可提高酶的分配系数。图6 聚乙二醇4000/硫酸铵系统中，支链淀粉酶的分配系数与硫酸铵总浓

9、度的关系 eg. 在PEG-DEX系统中加入NaClO4或KI，能增加上相对带正电物质的亲和效应，并迫使带负电物质进入下相；若加入Li3PO4，则与上述效应刚好相反。 因此，只要设法改变界面电位，就能控制蛋白质等荷电大分子转入某一相。图7 聚乙二醇葡聚糖系统中支链淀粉酶的分配与pH值的关系4、温度的影响 温度的变化虽然影响液相物理性质的变化，从而影响溶质在两相间的分配，但总的来说，影响不敏感。图8 不同温度下葡聚糖500/聚乙二醇6000/水系统相图七、双水相系统的应用食品工业生物行业表5 双水相萃取在生物分离中的应用酶的提取和纯化 菌体酶双水相组成细胞浓度/%分配系数收率/%Candida

10、Boidinii过氧化氢酶PEG-粗Dex202.9581Saccharomgces Cerevisine已糖激酶PEG/盐308.292Escherichia Coli天冬氨酸酶PEG1550/磷酸钾盐255.796表6 从破碎的细胞中萃取分离酶7细胞组织的分离 用三甲胺PEG/ Dextran 体系可分离含胆碱受体的细胞；病毒的纯化： 用PEG/ NaDS 体系可对脊髓病毒和腺病毒进行纯化,回收率可达90%生长激素的纯化：用PEG/ 盐体系可提纯人的生长激素,回收率Y= 60%；干扰素的分离： 用PEG- 磷酸酯/ 盐体系分离- 干扰素, Y= 97 %; 从重组大肠杆菌匀浆中提取- 干扰

11、素, Y= 99.15 % ,纯度提高25 倍生物小分子物质的分离： 双水相体系萃取分离技术对青霉素G钠盐等生物小分子物质的分离也可以取得理想效果；药物的分离和提纯： 如基因工程药物、抗菌素、动、植物药物的提取，也可以利用该技术开发我国传统的中草药； 在分析检测中的应用：液- 液分配层析(LL PC) 将一种聚合物连接在固体颗粒(支持物) 上，另一种聚合物的溶液作为流动相，这种柱层析技术可分离蛋白质、核酸以及细胞混合物。食品工业中用来从酸水解产物中提取风味物质： 二肽、氨基酸、核苷酸等八、双水相萃取的工艺流程目的产物的萃取PEG的循环无机盐的循环连续错流萃取回收酶的流程图九、成相聚合物的回收膜

12、处理沉淀离子交换和吸附电泳或亲和分配和双水相萃取相结合蛋白质分配在盐相：盐可用错流操作方式下，用超滤或渗析等膜过滤回收；蛋白质积聚在PEG中：加入盐使蛋白质重新分配到盐相中。PEG的分离同样可用膜分离来实现。十、双水相萃取技术的进展1、廉价双水相体系的开发体系优点缺点PEG/DEX盐浓度低，活性损失小价格贵，黏度大，分相困难PEG/盐成本低，黏度小盐浓度高，活性损失大，界面吸附多表6 两种双水相体系的比较 可见，高聚物-高聚物体系对活性物质变性作用小，界面吸附少，但价格高。因而寻找廉价的高聚物-高聚物体系是双水相萃取技术发展的一个重要方向。 目前比较成功的是用变性淀粉PPT代替昂贵的DEX。P

13、PT-PEG体系已被用于从发酵液中分离过氧化氢酶、 -半乳糖苷酶等。该体系具有很多优点：比PEG-盐体系稳定，与PEG-DEX体系相图相似；蛋白质溶解度大；黏度小；价格便宜。2、双水相萃取技术同其他分离技术结合 . 双水相体系同生物转化相结合图10 利用双水相体系将木质纤维素转化为乙醇流程利用葡萄糖和淀粉生产乙醇；利用葡萄糖生产丙酮丁醇；利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖；水解酪蛋白；发酵生产乳酸；将青霉素G转化为氨基青霉烷酸等. 双水相萃取技术同膜分离技术相合萃取物内侧流体外侧流体分配系数内侧流速/cm.s外侧流速/cm.s传质系数/cm/s细胞色素C磷酸盐PEG0.1816.36.65.5*10-6肌红蛋白 磷酸盐PEG0.0094.05.07.5*10-7尿激酶磷酸盐PEG0.6516.35.02.0*10-4表7 双水相萃取同膜分离结合的例子 . 双水相萃取同亲和层析相结合 在PEG或DEX上接上一定的亲和配基，这样不但使体系具有双水相处理量大的特点，而且具有亲和层析专一性高的特点。亲和配基亲和双水相亲和层析收率%处理量u/ml染料浓度umol.m收率%处理量