RealtimePCR简介课件(PPT 90页)

1、实时荧光定量PCR技术与应用北京元业伯乐科技发展有限公司第1页，共90页。第2页，共90页。提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析实时荧光定量PCR技术简介：第3页，共90页。PCR概念什么是PCR？Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定DNA片段的方法。第4页，共90页。PCR 循环第一步 加热变性、双链打开第二步退火、引物与单链结合第三步 - 引物延伸变为两个双链DNA第5页，共90页。第6页，共90页。常规PCR常规PCR技术：理

2、论上PCR产物的积累是按照2n指数扩增PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析DNA EngineS1 S2 M第7页，共90页。常规PCR常规PCR结合电泳分析方法的局限性 只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量对终产物分析，受PCR过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差1000%）存在扩增产物的污染问题。必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事而且EB有毒无法对扩增反应实时检测第8页，共90页。提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析实时荧光定量PCR技术简

3、介：第9页，共90页。定量PCR定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析IQ5 Real-time PCR仪第10页，共90页。定量PCR 实时荧光定量PCR三个关键词： 实时，荧光，定量 如何实时检测？ 借助荧光物质示踪扩增产物量的变化第11页，共90页。PCR反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶引物模板DNA或缓冲液荧光物质第12页，共90页。荧光曲线 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条

4、荧光扩增曲线图第13页，共90页。定量原理 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、Ct值第14页，共90页。定量原理荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)阈值线第15页，共90页。Ct值的概念定量原理Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-阈值线第16页，共90页。浓度低浓度高模板起始浓度越高，Ct值越小定量原理CT值与模板起始浓度的关系哪个样品浓度高？第17页，共90页。阈值选择阈值的选择荧光阈值是在荧光

5、扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上缺省设置一般是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑 第18页，共90页。实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。 Ct值的重现性第19页，共90页。终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性 Ct值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图第20页，共90页。定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩

6、增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率第21页，共90页。在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct =N (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:logX0= -log(1+Ex)*Ct+log N (3) Ct= -1/log(1+Ex)*logX0+log N/log(1+Ex) (4)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理第22页

7、，共90页。初始模板的对数值与循环数（CT值)呈线性关系初始模板量越多, 扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少确定初始模板的浓度定量原理第23页，共90页。Absolute（绝对定量）Determines input quantity of a nucleic acid targetRequires a standard curve Relative（相对定量）Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samplesPerformed with or without a st

8、andard curveTypically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene14500 copies定量方法 第24页，共90页。 定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。 绝对定量荧光强度-循环数曲线初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线.未知10410310610510210第25页，共90页。首先确定未知样品的 C(t)值 借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量得到未知样品初始

9、量绝对值unknown104103Unknown contains 3108 copies绝对定量第26页，共90页。相对定量相对定量CT 法 未进行归一化经过校正CT法 校正加入反应体系当中模板量 通常使用内参进行校正 第27页，共90页。CTCT 认为扩增效率为100% 只能使用一个内参进行校正Pfaffl Modification 根据扩增效率进行分析 只能使用一个内参进行校正Vandesompele Method 根据扩增效率进行分析 可以使用多个内参进行校正SimpleComplex第28页，共90页。CTGOITissue #2:Tissue #1:2224Delta Ct:24-

10、22 = 2Fold induction = 22 = 4第29页，共90页。Livak Comparative Ct Method (2-DDCt) for Relative Quantification1. Normalize C(t):C(t) = C(t)target - C(t)hskg2. Calculate C(t)Average:C(t)Ave = Average C(t) of replicates 3. Normalize to calibrator: C(t) = C(t)Sample Ave - C(t)Calibrator Ave(For calibrator, C(

11、t) = 0)4. Fold difference:F=2-C(t) = Normalized fold difference (For calibrator, 2-C(t) = 1)Note, this formula can be modified to account for reaction efficiencies (Dr. M. Pfaffl) and multiple reference genes (Dr. J. Vondosomple).相对定量 CT 第30页，共90页。ReferenceGOI21Tissue #2:Tissue #1:202224Delta Ct #2:

12、Delta Ct #1:22-21 = 124-20 = 41st DeltaDelta Ct:4-1 = 32nd DeltaFold induction = 23 = 8CT第31页，共90页。Relative QuantificationCtStarting quantity90%2422Problem with the CT第32页，共90页。Ct90%2422100%Starting quantityRelative QuantificationCT缺陷斜率不一样第33页，共90页。Efficiencytarget deltaCt target (control-sample)Fol

13、d induction = Efficiencyreference deltaCt reference (control-sample)Efficiency = 10-1/slope(Pfaffl, 2001; Nucleic Acid Research)Efficiencytarget deltaCt target (control-sample)Fold induction = Efficiencyreference deltaCt reference (control-sample)Relative Quantification Pfaffl第34页，共90页。Primer set #1

14、ReferencePrimer set #2 GOI21Tissue #2:Tissue #1:20222490% = 1.9Delta Ct:Efficiency:20-21 = -1100% = 224-22 = 22target deltaCt target (24-22 = 2)Fold induction = 1.9reference deltaCt reference (20-21 = -1)= 40.53= 7.50.537.5(From Standard curve)Relative Quantification Pfaffl Modification第35页，共90页。 DC

15、t 方法: (没有内参)表达倍数 : 4 DDCt 方法: (有内参)表达倍数 : 8Pfaffl 修正: (内参+效率)表达倍数 : 7.5方法比较第36页，共90页。与传统PCR的比较实现了初始模板的绝对定量检测灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因可以区分微小的拷贝数差异可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量省时省力检测设计灵活第37页，共90页。提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析实时荧光定量PCR技术简介：第38页，共90页。 SYBR Green 1 Molecular Beaco

16、ns TaqMan荧光化学第39页，共90页。SYBR Green ISYBR Green 1第40页，共90页。SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第41页，共90页。SYBR Green I 工作原理Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatBDBDBDBDBDBDBD

17、BDBDBDlllll第42页，共90页。SYBR Green I 工作原理第43页，共90页。SYBR Green I 优点 使用方便 - 不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性 - 可以用于不同的模板 便宜 灵敏第44页，共90页。SYBR Green I 缺点与非特异性产物结合无法实现多个目的基因的检测第45页，共90页。关于SYBR Green I一种最基础的实验手段评价引物特异性： 使用熔点曲线分析（ Melt Curve Analysis） 评价引物对扩增效率： 将模板进行梯度稀释研究最适反应条件： 使用梯度功能进一步优化实验条件第46页，共90页。Molecular Beacon

18、sMolecular Beacons发夹型杂交探针第47页，共90页。Molecular Beacons原理：荧光偏振能量传递（FRET） 茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎荧光素淬灭剂环第48页，共90页。变性: 产生非特异性的荧光Molecular Beacons第49页，共90页。Target-loop interaction more stable than stem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTarget退火时:探针与靶序列结合荧光素与淬灭剂分离发出荧光（靶序列特异的）Molecular Beacons 第50页，

19、共90页。延伸: 没有荧光Molecular Beacons SNP第51页，共90页。Molecular Beacons 实验结果第52页，共90页。Molecular Beacons 优点 对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 可以实现多通道检测 荧光背景低第53页，共90页。Molecular Beacons缺点 设计困难 只能用于一个特定的目标 价格较高 第54页，共90页。TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针第55页，共90页。TaqMan 目标特异性探针 5为荧光素， 3为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补第56页，共90页。5533d.

20、NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQTaqMan工作原理第57页，共90页。535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5lTaqMan工作原理

21、R3Q第58页，共90页。TaqMan实验结果第59页，共90页。TaqMan优点 对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测可以实现多通道检测 与 Molecular Beacons 相比设计 相对简单第60页，共90页。TaqMan缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析 背景高第61页，共90页。兼容化学试剂总结结合于双链DNA的小沟中发夹型杂交探针水解型杂交探针（5-3外切）延伸复性任何步骤定量和检测目标基因熔解曲线分析SNP分析定量和检测目标基因SNP分析定量和检测目标基因信号检测工作原理有否淬灭剂化学试剂否有有主要应用范围第62页，共90页。提纲 PCR简

22、介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析实时荧光定量PCR技术简介：第63页，共90页。多重PCR在一个PCR管中进行多个不同的PCR反应： 同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 目标基因 内参照基因（看家基因）不同荧光标记的探针识别不同的靶基因第64页，共90页。内参照基因 解决模板提取过程中造成的差别 解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别内参照基因第65页，共90页。多通道技术多通道技术：使用多种荧光染料在不同的检测通道内同时测定多种不同荧光染料发出的荧光第66页，共90页。1、引物及探

23、针问题-引物及探针的相互干扰2、不同PCR反应要在同样扩增条件下进行2、模板量差别-共用资源的相互竞争多重PCR技术问题一个PCR管内进行多重PCR扩增要解决的问题：第67页，共90页。FRRQFRRQFRRQRQ多重PCR技术问题1、引物及探针相互干扰问题第68页，共90页。FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ2、共用资源的相互竞争多重PCR技术问题第69页，共90页。单双通道同时进行，相互验证FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ单单双多重PCR技术问题第70页，共90页。提纲 PCR简介

24、 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因定量PCR技术延伸 熔解曲线分析 基因分型（SNP）检测实时荧光定量PCR技术简介：第71页，共90页。Temperature increasesFluorescencedecreasesTm Graph fluorescence intensity vs. temperature Decreasing fluorescence recorded - Due to increasing temperature - Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of

25、inflection on the melting curveSYBR Green I 融解曲线分析第72页，共90页。荧光强度值随温度变化速率对温度作图(-dI/dT)-dIdTTmSYBR Green I 融解曲线分析第73页，共90页。SYBR Green I 融解曲线分析10,000 copies非特异性产物目的产物目的产物10 copies第74页，共90页。10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲线扩增曲线1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5.

26、Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.SYBR Green I 融解曲线分析第75页，共90页。10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲线1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec

27、7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.扩增曲线SYBR Green I 融解曲线分析第76页，共90页。 进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓度 循环条件 变性温度和退火温度Real-time PCR体系优化第77页，共90页。利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化Real-time PCR体系优化第78页，共90页。45oC55oC65oC

28、溶解曲线扩增曲线1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.Real-time PCR体系优化第79页，共90页。提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因定量PCR技术延伸 熔解曲线分析 基因分型（SNP）检测实时荧光定量PCR技术简介：第80页，共90页。FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAllele-specific