《卫生化学》课件5.紫外1

1、第三章 紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and Visible Spectrophotometry, UV-Vis)2.1 紫外-可见吸收光谱2.2 吸收光谱的测量-Lambert-Beer 定律2.3 紫外-可见光度计仪器组成2.4 分析条件选择2.5 UV-Vis分光光度法的应用 UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的吸收特性。 UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在160780nm. UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV)为四大波谱之一，是鉴定 许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。 紫外-可见分光光度法：基于物质对光（2

2、00-700nm）的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法。仪器结构：光源单色器样品池检测器信号显示装置特点：灵敏度高、选择性好 准确度高、用途广泛一、电磁辐射与电磁波谱光电磁波辐射能 =c/E=h E=h =hc/ 结论：不同波长的光具有不同的能量 （eV）波长越短，能量越高 波长越长，能量越低紫外及可见光区的波长与能量之间的关系：(nm) 200 300 400 500 600 760 (eV) 6.20 4.13 3.10 2.48 2.07 1.632.1 紫外-可见吸收光谱一、分子吸收光谱的形成1. 过程：运动的分子外层电子-吸收外来辐射-产生电子能级跃迁-分子吸收谱(量

3、子化特性)。2. 能级组成：除了电子能级(Electron energy level)外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动(Vibration)能级和转动(Rotation)能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振-转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：其中Ee最大：1-20 eV; Ev次之：0.05-1 eV; Er最小：0.05 eV 可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大12个数量级，在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。 不同物质结构不同或者说其分子能级的能量(各种能级能量总和)或能量

4、间隔各异，因此不同物质将选择性地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是UV-Vis定性分析的基础。 定性分析具体做法是让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线，据吸收曲线的特性(峰强度、位置及数目等)研究分子结构。 物质吸收光时产生基态至激发态的跃迁，只有当入射光的能量与吸光物质的基态和激发态间的能量差相等时才会被吸收 不同物质结构不同或者说其分子能级的能量(各种能级能量总和)或能量间隔各异，因此不同物质将选择性地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是UV-Vis定性分析的基础。 定性分

5、析具体做法是让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线，据吸收曲线的特性(峰强度、位置及数目等)研究分子结构吸收曲线（定性依据）最大吸收波长（峰） 最小吸收波长（谷） 肩峰 末端吸收-胡罗卜素咖啡因阿斯匹林丙酮 几种有机化合物的分子吸收光谱图。有机分子能级跃迁1. 可能的跃迁类型 有机分子包括:成键轨道 、 ；反键轨道 *、*非键轨道 n CHHOoooo=o=n二、分子吸收光谱跃迁类型各轨道能级高低顺序： n*；可能的跃迁类型：-*；-*；-*；n-*；-*；n-*-*：C-H共

6、价键，如CH4（125nm）；C-C键，如C2H6(135nm)，处于 真空紫外区；-* 和-*跃迁：尽管所需能量比上述-*跃迁能量小，但波长仍处于 真空紫外区；n-*：含有孤对电子的分子，如H2O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl (173nm);CH3I(258nm)；(CH3)2S(229nm)；(CH3)2O(184nm) CH3NH2(215nm)；(CH3)3N(227nm)，可见，大多数波长仍小于 200nm，处于近紫外区。 以上四种跃迁都与成键和反键轨道有关（-*，-*，-*和n-*），跃迁能量较高，这些跃迁所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。

7、只有-*和n-*两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。 2. 几个概念：生色团（Chromogenesis group）： 分子中含有非键或键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起n-* 和-*跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。助色团（Auxochromous group） ： 含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。红移或蓝移（Redshift or blueshift）： 在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰向长波方向（红移）或短波方向移动（蓝移）的现象。那么促使分

8、子发生红移或蓝移的因素有哪些呢？1）共轭体系的存在-红移 如CH2=CH2的-*跃迁，max=165200nm；而1,3-丁二烯，max=217nm2）异构现象：使异构物光谱出现差异。 如CH3CHO含水化合物有两种可能的结构：CH3CHO-H2O及CH3CH(OH)2; 已烷中，max=290nm，表明有醛基存在，结构为前者；而在水溶液中，此峰消失，结构为后者。3）空间异构效应-红移 如CH3I(258nm), CH2I2(289nm), CHI3(349nm)4）取代基：红移或蓝移。 取代基为含孤对电子，如-NH2、-OH、-Cl，可使分子红移；取代基为斥电子基，如-R，-OCOR，则使分

9、子蓝移。 苯环或烯烃上的H被各种取代基取代，多产生红移。5）pH值：红移或蓝移 苯酚在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及270nm两个吸收带；而在碱性溶液中，则分别红移到235nm和 287nm（p- 共轭）.6）溶剂效应：红移或蓝移 由n-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，形成 H 键的能力增加，发生蓝移；由-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，激发态比基态能量有更多的下降，发生红移。 随溶剂极性增加，吸收光谱变得平滑，精细结构消失。无机物分子能级跃迁 一些无机物也产生紫外-可见吸收光谱，其跃迁类型包括 p-d 跃迁或称电荷转移跃迁以及 d-d, f-f 跃迁或称配场跃迁。1. 电荷转

10、移跃迁 (Charge transfer transition) 一些同时具有电子予体(配位体)和受体(金属离子)的无机分子，在吸收外来辐射时，电子从予体跃迁至受体所产生的光谱。max 较大 (104以上)，可用于定量分析。2. 配场跃迁(Ligand field transition) 过渡元素的 d 或 f 轨道为简并轨道(Degeneration orbit)，当与配位体配合时，轨道简并解除，d 或 f 轨道发生能级分裂，如果轨道未充满，则低能量轨道上的电子吸收外来能量时，将会跃迁到高能量的 d 或 f 轨道，从而产生吸收光谱。 吸收系数 max 较小 (102)，很少用于定量分析；多用

11、于研究配合物结构及其键合理论。无配场八面体场四面体场平面四面形场 d 轨道电子云分布及在配场下的分裂示意图2.2 吸收光谱的测量-Lambert-Beer 定律一、 几个术语透光度和吸光度当强度为I0的入射光束通过装有均匀待测物的介质时，该光束将被部分吸收(Ia)，未被吸收的光将透过待测物溶液以及通过散射(It)、反射(Ir),包括在液面和容器表面的反射)而损失，这种损失有时可达10%，那么，I0=Ia + It +I r 简化为I0=Ia + It 因此，在样品测量时必须同时采用参比池和参比溶液扣除这些影响！透射光强度与入射光强度之比称为透光度（Transmittance）,用T表示： T=

12、It / I0物质对光的吸收程度，称吸光度（absorbance）A= - lgT光的吸收定律郎伯-比尔定律透光度和吸光度二、Lambert-Beer 定律 当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比，即k 为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。 当浓度以 g/L 表示时，称 k 为吸光系数，以 a 表示，即 当浓度以mol/L表示时，称 k 为摩尔吸光系数，以 表示，即 比 a 更常用。 越大，表示方法的灵敏度越高。 与波长有关，因此， 常以表示。三、偏离 L-B 定律的因素 样品吸光度 A 与光程 b 总是成正比。但当 b 一定时，A 与 c 并不总是成正比，即偏

13、离 L-B 定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。1. 样品性质影响a）待测物高浓度-吸收质点间隔变小质点间相互作用对特定辐射的吸收能力发生变化- 变化；b）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；c）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；d）胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。 2. 仪器因素 仪器因素包括光源稳定性以及入射光的单色性等。a）入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致测定偏差。 假设入射光由测量波长x和干扰i波长组成，据Beer定律，溶液对在x和i 的光的吸光度分别为：综合前两式，得 当x=i时

14、，或者说当x=i时，有A=xbc, 符合L-B定律； 当xi时，或者说当xi时，则吸光度与浓度是非线性的。二者差别越大，则偏离L-B越大； 当xi，测得的吸光度比在“单色光” x处测得的低，产生负偏离；反之，当xi，则产生正偏离。b）谱带宽度与狭缝宽度：“单色光”仅是理想情况，经分光元件色散所得的“单色光”实际上是有一定波长范围的光谱带(即谱带宽度)。单色光的“纯度”与狭缝宽度有关，狭缝越窄，它所包含的波长范围越小，单色性越好。2.3 紫外-可见光度计仪器组成 紫外-可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成。一、光源 对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。1

15、. 钨及碘钨灯：3402500 nm，多用在可见光区；2. 氢灯和氘灯：160375nm，多用在紫外区。二、单色器(Mnochromator) 与原子吸收光度仪不同，在UV-Vis光度计中，单色器通常置于吸收池的前面！（可防止强光照射引起吸收池中一些物质的分解） 组成：色散元件 狭缝 色散元件：棱镜 利用不同波长光线折射率不同 光栅 利用光的衍射和干涉作用 色散波长范围宽三、吸收池(Cell，Container)： 用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。四、检测器： 1. 光电管 2. 光电倍增管 五、信号显示装

16、置二、紫外可见光度计仪器 分光光度计分为单波长和双波长仪器。1. 单波长分光光度计 单光束 双光束（空间分隔） 双光束（时间分隔）特点： 因光束几乎同时通过样品池和参比池，因此可消除光源不稳产生的误差。 光源检测器单色器单色器切光器吸收池双波长分光光度计示意图2. 双波长分光度计通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差A。SB1和SB2分别为在1和2处的背景吸收，当1和2 相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服

17、了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。 3. 分光光度计的校正 当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移，因此需要对其进行校正。波长标度校正： 使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。吸光度标度校正： 采用 K2CrO4 标准液校正（在25oC时，于不同波长处测定0.04000g/L的 KOH 溶液（0.05mol/L）的吸光度 A，调整光度计使其A 达到教材 P31 中表 2.1 所列的吸光度。2.4 分析条件选择一、仪器测量条件 由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。由L-B定律：微分后得： 将上两式相比，

18、并将 dT 和 dc 分别换为T 和 c，得 当相对误差 c/c 最小时，求得T=0.368 或 A=0.434。即当A=0.434 时，吸光度读数误差最小！ 通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.151.00范围内。 三、仪器测量条件（一）入射光波长： max（提高测量灵敏度）（二）狭缝宽度：合适的狭缝宽度是以减小狭缝宽度时样品的吸光度不在增加为标准。四、吸光度读数范围二、反应条件选择 显色剂的选择原则： 使配合物吸收系数 最大、选择性好、组成恒定、配合物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。2. 显色剂用量： 配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格

19、控制。3. 溶液酸度：配位数和水解等与 pH 有关。4. 显色时间、温度、放置时间等。三、参比液选择 溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；2. 试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；3. 试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。(一) 显色剂用量 原则：过量、适量、定量最佳显色剂用量可通过条件试验确定：A M N C(二)酸度 最佳酸度可通过条件试验确定。A M N pH四、干扰消除1. 控制酸度： 配合物稳定性与pH有关，可以通过控制酸

20、度提高反应选择性，副反应减少，而主反应进行完全。如在0.5MH2SO4介质中，双硫腙与Hg2+生成稳定有色配合物，而与Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+等离子生成的有色物不稳定。2. 选择掩蔽剂3. 合适测量波长4. 干扰物分离5. 导数光谱及双波长技术2.5 UV-Vis分光光度法的 应用一、定性分析1. 制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱对照；2. 利用Woodward-Fieser 和Scott经验规则求最大吸收波长。 即，当通过其它方法获得一系列可能的分子结构式后，可通过此类规则估算最大吸收波长并与实测值对比。Woodward-Fieser规则Woodward-Fieser规则估算

21、最大吸收波长的几个实例：四二、定量分析1. 单组份定量方法1）标准曲线法（略）2）标准对比法： 该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由Ax=kcx求出cx 该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且cx与cs大致相当时，才可得到准确结果。2. 多组分定量方法 由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。 设试样中有两组份 X 和 Y，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：图a)：X,Y 组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。图b)和c) ：X,Y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X

22、和Y的浓度：其中，X,Y 组份在波长 1 和 2 处的摩尔吸光系数 可由已知浓度的 X, Y 纯溶液测得。解上述方程组可求得 cx 及 cy。 3. 双波长法-等吸收点法 当混合物的吸收曲线重迭时，如右下图所示，可利用双波长法来测定。具体做法：将 a 视为干扰组份，现要测定 b 组份。a)分别绘制各自的吸收曲线；b)画一平行于横轴的直线分别交于a组份曲线上两点，并与b组分相交；c)以交于 a 上一点所对应的波长 1 为参比波长，另一点对应的为测量波长 2，并对混合液进行测量，得到： A1=A1a + A1b + A1s A2 =A2a + A2b + A2s若两波长处的背景吸收相同，即A1s=

23、 A2s二式相减，得，A=(A2a- A1a)+( A2b- A1b)由于 a 组份在两波长处的吸光度相等，因此， A=( A2b- A1b)=(2b-1b)lcb从中可求出cb同理，可求出ca.4. 系数倍率法 情况同上。但其中一干扰组份 b 在测量波长范围内无吸收峰时，或者说没有等吸收点时可采用该法。具体做法：同前法可得到下式，A1=A1a + A1bA2 =A2a + A2b两式分别乘以常数k1、k2并相减，得到，S=k2(A2a+A2b)-k1(A1a+A1b)=(k2A2b-k1A1b)+(k2A2a-k1A1a)调节信号放大器，使之满足k2/k1=A1b/A2b，则S=(k2A2a

24、-k1A1a)=(k22-k11)lca因此，差示信号只与 ca 有关，从而求出 ca。同样可求出cb。5. 示差分光光度法测量原理：当试样中组份的浓度过大时，则A值很大，会产生读数误差。此时若以一浓度略小于试样组份浓度作参比，则有： 具体做法：以浓度为cs的标准溶液调T=100%或A=0（调零），所测得的试样吸光度实际就是上式中的A，然后求出c，则试样中该组份的浓度为(cs+c)。6. 导数光谱法1）定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。导数光谱是解决干 扰物质与被子测物光谱重叠，消除胶体等散射影响和背景吸收，提 高光谱分辨率的一种数据处理技术。2）原理： 已知 ， 对波长求一阶导数，得控制仪器使I0在整个波长范围内保持