分子印迹固相萃取光谱法快速检测猪肉中左氧氟沙星

1、分子印迹固相萃取光谱法快速检测猪肉中左氧氟沙星摘要以表面接枝乙烯基的硅胶为载体，左氧氟沙星 为模板分子合成了选择性识别左氧氟沙星的印迹聚合物。 使用元素分析、红外光谱对制备的聚合物进行表征，通过动 态吸附及选择性吸附进行性能测定。结果表明，此印迹聚合 物最大吸附量达56.33 mg/g印迹因子为2.62将所合成的 硅胶表面左氧氟沙星分子印迹聚合物用于实验室自主开发 的分子印迹固相萃取漫反射光谱检测装置，对左氧氟沙星进 行定量分析。样品经此装置固相萃取后，不经洗脱，直接对 固相萃取介质进行漫反射光谱测定，简化了操作过程，提高 了灵敏度。标准曲线的回归方程为A=0.0496C+02412线性 范围

2、为0.2尸9.0 mg/L相关系数R2=0.9924,检出限为0.24 mg/L。猪肉样品中的加标回收率为89.1%一92.0%,相对标准 偏差RSD为3.4%7.9%(n=3)。相比于传统的富集分离技术， 本方法具有装置小型化和集成化、灵敏度和选择性高、成本 低、简单快速等优点。关键词分子印迹；左氧氟沙星；固相萃取；漫反射 光谱1引言分子印?E聚合物是一种基于模板分子和功能单体之间 相互作用的选择性富集材料。传统的合成分子印迹的方法主 要有本体聚合法、原位聚合法和沉淀聚合法11但传统方法 存在模板分子洗脱不完全、识别位点结合效率低、传质速率 慢等缺点：21相比于其它方法，表面印迹制备技术在支

3、撑材 料的表面构建分子识别系统3一7。由于其识别位点位于材 料表面，使得模板分子更易与识别位点结合，可快速达到饱 和吸附，因此具有良好的热稳定性、较高的结合速率以及较 大的吸附容量8一10。目前常用的支撑印迹材料主要有硅胶 纳米微球11, 12、硅胶纳米管13及磁性纳米微球等141膜富集在线漫反射光谱检测技术，又称膜固相萃取光谱 技术，在被测组分富集后不经洗脱而在固相材料上直接测定 固相光谱，方法简单、快速、灵敏，选择性较好151 Wang 等16将膜固相萃取技术与紫外可见光谱结合，利用金属离 子与络合剂反应生成有色疏水络合物，然后将有色络合物富 集到滤膜上，无需洗脱，直接对滤膜上的物质进行检

4、测。Li等 17对常规的膜富集过程进行改进，构建了一种多通道膜富 集装置测定饮料和河水样品中罗丹明B的浓度，利用多通道 富集装置，将多个样品富集在同一张膜上，最大限度减小实 验中所用膜的差异性。Wei等18提出了一种快速、简单、 灵敏的膜富集固相萃取结合漫反射光谱定量检测光气的方 法，操作简单，背景干扰少。在膜固相萃取光谱技术基础上，本研究选用分子印迹作 为富集材料，发展了一种分子印迹固相萃取在线漫反射检测 技术，进一步提高了检测目标分子的选择性。以表面接枝乙 烯基的硅胶为载体，合成了左氧氟沙星印迹聚合物，并将此 聚合物应用于分子印迹固相萃取光谱技术中，实现了猪肉中 抗生素左氧氟沙星19的快速

5、检测。2实验部分2.1仪器与试剂Evolution 22紫外-可见分光光度计（赛默飞世尔科技有 限公司）；SHB三循环泵真空泵（上海卫铠水仪器设备有限 公司）；超声波清洗器（上海声彦超声仪器有限公司）； DZF-6020真空干燥箱（上海予英仪器有限公司）；实验用水 为超纯水018.2 MQ?cm, SARTORIUS arium611DJGermany ）。HCl、甲醇（永华科技（江苏）有限公司）；硅胶（200一 300目，上海盛亚化工有限公司）；甲苯、丙酮（国药集团 化学试剂有限公司）；甲基丙烯酸（MAA ,上海凌峰化学 试剂有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA ,日本东 京化成工业株

6、式会社）；偶氮二异丁睛（AIBN）、3号基丙烯 酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH-570）、乙酸（上海晶纯生化 科技股份有限公司）。2.2硅胶活化与硅烷化称取硅胶10 g于250 mL圆底烧瓶中，加入150 mL 10%HCl, 110C搅拌12 h用超纯水洗全中性，在120C下真空 干燥12 h以增加硅胶表面的羟基数目，并除去硅胶表面的 杂质。称取活化好的硅胶，加入100山1甲苯、10 mL KH-570 在氮气保护下110C回流12 h产物依次用甲苯、甲醇、丙 酮洗涤过滤，在60C条件下真空干燥过夜，得到表面硅烷化 偶联剂的硅胶：612.3左氧氟沙星分子印迹聚合物(MIP )的制备称取模板分子

7、01852 g(0.5 mmol)和功能单体MAA 0.1812 g(2 mmol)溶于 50 mL 甲醇-甲苯(9 : 1, V/V)混 合溶剂中，超声30 min,静置过夜。加入1 g硅烷化硅胶、 交联剂 EDMA 10 mmol (2.0435 g、引发剂 AIBN 30 mg 反 复充氮排氧后密封，60C保温并在磁力搅拌下反应24 h将 产物过滤，并用甲醇洗涤。用甲醇-乙酸(9： 1, V/V)索氏 提取，除去模板分子，直至提取液中未检测到左氧氟沙星的 信号为止(采用紫外可见分光光度法检测左氧氟沙星)。将 得到的MIP用丙酮沉降以及甲醇洗涤后，过滤，60C条件下 真空干燥12 h获得左

8、氧氟沙星MIP。合成非分子印迹(NIP) 的过程与MIP过程相同，只是不加模板分子。2.4聚合物的表征2.4.1吸附动力学曲线的测定准确称取MIP 20 mg至10 mL左氧氟沙星溶液的离心管中，室温下分别振荡5、10、20、 40、80和100 min离心，取上清液，用紫外可见分光光度计测量上清液的浓度。按照公式（1）计算吸附量Q （mg/g）Q=（C0-Cx）V/m（1）其中，C0为吸附前左氧氟沙星的初始浓度（mg/L）； Cx 为吸附后左氧氟沙星的平衡浓度（mg/L）； V为溶液的体积 （mL）； m为聚合物质量（g）。2.4.2吸附等温线的测定准确称取20 mg MIP全装有10 mL

9、左氧氟沙星溶液的离 心管中，室温下振荡10 min离心，取上清液，用紫外可见 分光光度计测定吸附后上清液的浓度。NIP重复上述步骤。 根据吸附前后溶液中左氧氟沙星的浓度计算MIP及NIP的吸 附量。印迹因子是评价分子印迹特异性的重要参数，按照公 式（2）计算：a =QMIP/QNIP （2）其中a为印迹因子；QMIP为MIP平衡时的吸附量 （mg/g ） ； QNIP为NIP平衡时的吸附量（mg/g ）。2.4.3吸附选择性的测定 准确称取20 mg MIP,分别加 入10 mL 100 mg/L的左氧氟沙星、恩诺沙星、四环素标准溶 液，室温下振荡4 h离心，测上清液浓度。同样处理NIP。 根

10、据公式（1）计算各自吸附量。用分配系数KD、选择性系 数k和相对选择性系数k考察聚合物的吸附特异性：KD = Qe/Ce k=KD 氧氟沙星/KDi, k = kMIP/kNIP其中，Qe （mg/g ）为平衡吸附量，Ce （mg/mL ）为吸 附平衡时上清液中左氧氟沙星等的浓度，KD和KDi分别为氧氟沙星和竞争分子的分配系数，kMIP和kNIP分别为MIP 和NIP的选择性系数。2.5猪肉样品的提取与净化猪肉样品购于本地超市，称取10 g于50山1烧杯中，加 入10 mL磷酸盐缓冲溶液（pH=7）作为提取液，超声10 min 后，3000 r/min离心5 min上清液移至另一烧杯中，向残

11、渣中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH =7），重复上述操作1次， 合并上清液。LC-C18固相萃取柱依次用2.0山1的甲醇、磷酸 盐缓冲液淋洗活化，取上清液进行上样，用10 mL甲醇洗脱 2次。收集洗脱液于50山1离心管中，备用。实际样品猪肉 中末检测出左氧氟沙星，向猪肉样品中添加2、5和9 mg/L 的左氧氟沙星，测定回收率。2.6分子印迹固相萃取光谱的检测本实验利用所制备的印迹聚合物代替膜材料，进行固相 萃取光谱检测。设计了专门的富集分离和光谱检测装置，如 图1所示，此装置含有能够截留吸附材料的富集模块5,模 块上下有通道孔1和2,用于吸附材料的填装和样品溶液的 流入和流出。在真空或压力的

12、作用下，样品溶液通过富集模块5上侧 的孔道1流过吸附材料，进行富集和分离，滤液通过下方的 孔道2流出。此装置的上下端均用反光铝片3、4进行封装， 侧面使用铝箔进行封装，保证整个装置不漏光。富集后，在 富集端直接测定漫反射紫外光谱。准确称取60 mg MIP装填于封装型富集分离装置中，富 集20 mL不同浓度的左氧氟沙星标准溶液或猪肉样品洗脱液, 将装置直接放置在紫外可见漫反射吸收光谱仪上检测。3结果与讨论3.1表面印迹材料的表征3.1.1元素分析活化硅胶和硅烷化硅胶的元素分析结 果表明，活化硅胶表面的碳、氢元素含量均低于050%；活 化硅胶表面接枝KH-570后，碳、氢元素含量分别提高到9.7

13、9% 和1.51%。表明硅烷化偶联剂KH-570已成功接枝到硅胶表面。3.1.2红外光谱分析 在活化硅胶的红外光谱图（图2） 中，1103 cm1是SiOSi的伸缩振动峰，973 cm1是SiOH的伸 缩振动峰，3445和1635 cm1是OH的伸缩振动峰，表明硅 胶经过酸活化后表面富含活性的羟基。由图2可见，羟基的 相对强度明显减弱，973 cm1处的SiOH吸收峰消失，硅烷化 后的CO的特征吸收峰在1721 cm1。表面印迹聚合物MIP的 红外谱图中，聚合物中酯基的不对称伸缩振动和对称伸缩振 动吸收峰在1148 cm11厂21。3.2印迹聚合物对氧氟沙星的吸附性能吸附动力学实验结果表明，在

14、010 min表面印迹材 料对左氧氟沙星的吸附量迅速增加，并达到平衡。吸附时间 明显快于以沉淀聚合方法制备的聚合物23这是由于表面印迹方法制备的聚合物的识别位点暴露在外面，因而MIP具 有很快的传质和吸附速度。随着左氧氟沙星浓度的逐渐增大，印迹聚合物和非印迹 聚合物的吸附量也逐渐增加（图3），当左氧氟沙星浓度大于 800 mg/L后，印迹聚合物的吸附量已趋于平衡。说明在此浓 度下，印迹聚合物对左氧氟沙星的吸附已经达到平衡，处于 饱和状态，吸附容量为56.33 mg/g在相同浓度下，MIP的 吸附量明显高于NIP的吸附量，这是因为MIP中存在与左 氧氟沙星空间结构、尺寸大小、结合位点完全匹配的孔

15、穴， 这些特异性的结合位点增强了左氧氟沙星与印迹聚合物的 亲和性。而非印迹聚合物缺少特异性结合位点，对左氧氟沙 星的吸附为非特异性的表面物理吸附，吸附容量为21.5 mg/g 吸附容量小。通过计算得出印迹聚合物的印迹因子为2.62 说明此印迹聚合物具有较高的特异性24 25。3.3印迹聚合物的选择性能研究在相同的初始浓度下，印迹聚合物对左氧氟沙星的吸附 量远大于四环素和恩诺沙星，说明此印迹聚合物对左氧氟沙 星具有良好的识别力。MIP对于四环素和恩诺沙星的选择性 系数k分别为7.82和19.49, MIP相对NIP的相？ p三裥韵 凳？成别为1.05. 1.36以上结果说明，MIP对左氧氟沙星

16、具有良好的吸附能力（图4）。3.4印迹聚合物在固相萃取光谱检测中的应用将左氧氟沙星分子印迹聚合物材料装填在图1的装置中, 富集不同浓度的左氧氟沙星标准溶液，富集后直接放置在紫 外可见漫反射吸收光谱仪上检测光谱，检测波长为297 nm， 图5是标准曲线图。线性方程为A=0.0496C+0.241? R2=0.9924, 线性范围为02尸9.0 mg/L其中C为左氧氟沙星的浓度 (mg/L ), A为左氧氟沙星/甲醇溶液在297 nm下的吸光度值, 检出限为0.24 mg/L(3。)。对猪肉样品中左氧氟沙星进行了 检测，结果见表1。左氧氟沙星在猪肉样品中的加标回收率 为89.1%一92.0%, R

17、SD为3.4%一7.9% (n=3)。国标方法采用 液相色谱枝谱法检测左氧氟沙星，步骤繁琐、仪器要求高26 本方法简单快速、易于操作、成本低、便于携带，有望应用 于大量样品的现场快速筛查。4结论本研究合成了硅胶表面左氧氟沙星分子印迹聚合物，其 对左氧氟沙星有较强的吸附能力，吸附量为QMIP=56.33 mg/g,在10 min内接近饱和吸附，具有快速富集的能力。将 所合成的左氧氟沙星分子印迹聚合物与固相萃取光谱技术 相结合检测左氧氟沙星，检出限为0.24 mg/L对猪肉样品进 行检测，加标回收率在89.6%一92.0%之间，RSD为3.4%一7.9%, 可满足实际分析要求。本方法简单、快速，灵

18、敏度高，选 择性好，为食品中抗生素的快检提供了一种新方法。ReferencesWackerlig JSchirhagl R. Anal. C,hem016, 88(1):250-261Li ,Q Su H, Tan T. Biochem. Engineer. 2008, 38 (2)： 212-218Gao B An F Zhu Y.Polymr 2007， 48(8)： 2288-2297Xu，Xu W， Zhang X Yang Y. Microchim. Act2010, 171 (3): 441-449ZHOU Yan-Mei XU Wen-Guo , TONG Ai-Jun. Chi

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