单细胞毛细管电泳免疫分析

1、单细胞毛细管电泳免疫分析单细胞分析要求超小体积、灵敏度高(amolzmol, 10 n1021mol/L。)、选择性好、响应 速度快的分析技术.由于毛细管电泳能满足上述要求，在单细胞分析中研究及应用最为广泛.毛细管电泳是20世纪80年代发展起来的一种高效分离方法，由于毛细管电泳采用极细内径 的弹性石英毛细管作为分离载体，是一种很适合于进行单细胞分析的方法.首先，毛细管的 内径和大多数细胞的直径在同一个数量级上(大多数细胞的直径在5100m之间)；其次， 由于毛细管内径较小，因此毛细管电泳的进样量比其他分析方法要小得多，这对于单细胞分 析是十分重要的；第三，毛细管电泳可以高效分离细胞中多种复杂成

2、分；第四，通常可以在 较短的时间内完成分析过程；最后，毛细管柱本身可以作为检测前细胞成分衍生的场所.基 于以上的特点，近年来，毛细管电泳已经成为细胞生化研究的重要手段之一，许多研究者都 努力将毛细管电泳应用于单细胞分析.根据我们不完全统计，从19862004年之问，有关 单细胞毛细管电泳分析的文献超过1900篇，而且呈现逐年递增的趋势.免疫分析是利用抗体抗原反应高特异性的分析方法.因为样品中大量基体一般不产生免疫性 识别，免疫反应的选择性好、灵敏度高，在临床、环境化学和食品工业等领域得到广泛应用.毛 细管电泳技术的发展及其在免疫分析上的应用，使其发展成为一种新型免疫分析技术毛细 管电泳免疫分析

3、(capillary electrophoretic immunoassay， CEIA) .毛细管电泳免疫分析 具有进样少、分离时间短、受外界干扰小、可自动化处理、检测限低、孵育时间短等优点， 近十几年来，CEIA发展非常迅速，在单细胞分析中的应用正在逐步展开.5. 2单细胞毛细管电泳免疫分析在典型的毛细管电泳免疫分析中，一般包括进样、分离和检测三个步骤但是在单细胞分析 中，细胞的进样和检测是核心的问题，近年来，随着各种分析手段的不断完善和进步，进样 和检测的水平都有了很大的提高.单细胞毛细管电泳免疫分析与传统的毛细管电泳免疫分析相似，依据的标准不同，分类也不 同.分离模式有在线分析和离线分

4、析两种方式，也可以分为竞争免疫分析和非竞争免疫分析 两种模式.下面分别以在线分析和离线分析两种方式对单细胞毛细管电泳免疫分析进行介 绍.5. 2. 1在线分析绵羊血红细胞的研究 毛细管电泳芯片结合免疫方法分析血液中的多种组分研究较多-3,但分析血红细胞的研究 却不多嘲，用于临床与医疗方面快速分析白细胞、红细胞及淋巴细胞的方法更少.2(302年，Ichiki： 51报道利用毛细管电泳芯片结合免疫分析快速测定细胞类型的方法，在电场作用 下，细胞和免疫球蛋白向相反方向迁移，然后发生免疫反应.由于免疫反应减 少了细胞表面的电荷，因此。没有发生免疫反应的细胞比免疫反应后细胞的迁移速率慢，通 过测定细胞迁

5、移速率来判断每个细胞的免疫性，图5. 1是实验原理示意图.实验中使用的血红细胞从绵羊全血中分离获得，细胞样品的浓度为108个/mL，抗体是抗绵 羊红细胞的多克隆抗体，采用的是非竞争免疫模式.电泳缓冲溶液是0. 15mol/L。pH 7. 4 巴比妥（含1%凝胶）溶液，检测器是带CCD相机的光学显微镜（图5. 2）.右边是细胞储藏池， 左边是抗体储藏池，在电场作用下，细胞和抗体分别向相反方向迁移，然后相遇发生免疫反 应，免疫反应平衡后，与抗体结合的细胞和游离的细胞（没有与抗体结合的细胞）都向正极迁 移，迁移到检测窗口时，被分别检测.由于血红细胞在生理条件下带负电荷，而免疫球蛋白带正电荷，因此，游

6、离细胞的迁移速率 比与抗体结合后细胞的迁移速率慢，而且细胞结合抗体量越多，细胞的迁移速率越大，如图 5. 3所示.连续检测单个胰腺细胞释放胰岛素胰岛素的主要功能是调节血糖的浓度关于胰岛素的研究，要求对胰岛素的释放进行实时检测，尤其是对单个胰腺p一细胞的动力学研究此外，胰岛素分 泌的快速检测，对于胰腺移植的评价也非常有用，对于1号糖尿病，胰腺移植是一种非常有 前景的治疗方法。71. Kennedy等。8。米用竞争免疫分析模式，利用微流控芯片连续检测 单个胰腺p一细胞释放胰岛素，图5. 4是微流芯片的装置图.实验中，首先利用一个微管将单个胰腺f3 一细胞转移到微流通路的孔中，孔中加入含有3 mm0

7、1/L。葡萄糖的RPM11640培养液，几分钟后，逐滴加入lmol/L。葡萄糖使葡萄糖的最终 浓度为20 mmol/L 一，刺激胰腺8 一细胞分泌胰岛素，然后，FITC标记的胰岛素和单个胰 腺p细胞所分泌的胰岛素，同有限量的胰岛素抗体竞争反应，利用荧光显微镜进行检测利 用这种毛细管电泳芯片，可以在线监测单个胰腺8一细胞分泌胰岛素（图5. 5）.实验结果 表明：在15 s内可以完成一次胰岛素释放的分析，而游离胰岛素与胰岛素免疫复合物可以 在5 s内达到完全分离人杀伤细胞中T-干扰素的测定7 一干扰素是一种相对分子质量在2000025000之间，有三种不同形态的多功能蛋白质， 它可以由人的正常杀伤

8、细胞产生，在抗病毒感染、抗细胞增殖以及免疫调节等方面有着重要 的作用.但是有关人的正常杀伤细胞中了一干扰素的报道却很少.2004年，金文睿研究组报道了一种利用毛细管电泳免疫 分析测定单个人的正常杀伤细胞中不同形态7干扰素的方法.图5. 6是细胞进样装置，进样过程如下：将细胞储存池置于400倍光学显微镜下，将毛细 管柱插入细胞溶液中(事先将毛细管柱进样一端的聚丙烯酰胺涂层去除大约5 mm左右)，当 细胞漂浮到毛细管柱进样端时，采用电动进样方式将细胞吸到毛细管内，利用超声波将细胞 膜破膜，然后采用压力进样方式将异硫氰酸盐荧光素标记抗体进样，采用非竞争免疫分析模 式，在线分离方式，对单个人的正常杀伤

9、细胞中不同形态7一干扰素进行了分析.实验结果表明，7一干扰素标准品中有三种不同形态的7一干扰素，但在人的正常杀伤细胞 及其细胞提取液中只有两种不同形态的7 一干扰素(分别见图5. 7和图5. 8).5. 2. 2离线分析血管平滑肌细胞的非正常增殖是导致动脉硬化的主要原因，它是由一系列生长因子和生长抑 制剂来调节.BMP 一 2(bone morphogenic prorein 2)是近期发现的一种新的生长抑制剂， 是转移生长因子超家族中的一员。研究表明，BMP 一 2与动脉硬化的形成有关。1j.最初毛细管电泳免疫分析是建立在激光诱导荧光(LIF )检测器的基础上，由于瑞利散射、拉 曼散射以及试

10、剂中的荧光素杂质的影响，在1。IF检测中，背景噪声一直较高，成为影响I， IF检测方法的主要弊端之一.最近程介克等u .报道了一种利用毛细管电泳免疫分析结合化 学发光检测咎新向管平滑HI纲晌审RMP 一？的古涣.RMP才的枪小限县6才DmO1/T.将状态良好的血管平滑肌细胞转移到载片上，首先加入过量的抗BMP 一 2抗体，孵育一段时 间后，再加入过量的二抗孵育一段时间，然后加入过量的辣根过氧化酶(HRP)孵育一段时间 后，用细胞刷将细胞从载片上刮下来，然后进样利用毛细管电泳进行分析.实验采用他们自组装的仪器装置如图5. 9所示，NaH。P0。Na2 HP()a缓冲溶液，采用对碘 苯酚作为增强剂，利用辣根过氧化酶(HRP)催化鲁米诺/Hz0。的反应，采用柱后检测方式， 对血管平滑肌细胞中的BMP 一 2进行分析.他们对动脉血管硬化病理进行了初步研究.采用产生动脉硬化的因子血管紧张素II(A91/) 刺激血管平滑肌细胞，发现不同的刺激时问对BMP 一 2的影响较大.开始刺激6 h，BMP 一 2量增大，如图5. 10(c)所示，表明动脉硬化被抑制.刺激12 h以上，BM