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文档简介

1、第三章 抗体制药(二)3学时2021/7/18 星期日三、多功能抗体及其制备近年来,在scFv(单链抗体)的基础上,可以把两个或两个以上的scFv重组在一起,由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体(简称多价微抗)。包括双链抗体(diabody),三链抗体(triabody),微型抗体(minibody)及四链抗体(tetrabody)。2021/7/18 星期日多功能抗体及其制备双链抗体制备方法:化学交联法、粘性蛋白结构域融合法和接头长度控制法。微型抗体:通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH结构域与IG的CH3结构域融合,形成VL-VH-CH3的结构。此种抗体合成后通过C

2、H3结构域形成稳定的二聚体形式,发挥其双价微抗的作用。三链抗体:在制备单链抗体时,当接头的长度为2个或2个以下氨基酸残基时,或者直接把VH结构域N末端与VL结构域C末端相连,通过非共价键而形成三聚体,称三链抗体。2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日抗体融合蛋白抗体的一部分被非抗体序列替代,所形成的融合蛋白具有新的特性,称之为抗体融合蛋白。根据构建方式的不同,抗体融合蛋白主要分为两种形式:2021/7/18 星期日构建抗体融合蛋白的原则 将第一个蛋白的终止密码子删除,再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因,即可实现两个基因的共表达。抗体酶,酶-抗体型融合蛋白,在药物治疗中有广阔的

3、前景,它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物,从而避免了对正常组织的损害。2021/7/18 星期日四、基因工程抗体和抗体工程抗体研究的三大阶段: 1890年白喉抗毒素多克隆抗体; 1975年杂交瘤技术单克隆抗体; 1994年开始基因工程抗体基因工程抗体:不用人工免疫动物和细胞融合技术,完全用基因工程技术制备人源性抗体,而且还能利用基因转移和表达技术,通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生产抗体。2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日噬菌体抗体库技术的基本方法 获取目的基因抗体库技术的载体淘筛表达与鉴定2021/7/18 星期日获取目的基因和载体获取目的基因:提取mRNA

4、经反转录PCR获取抗体某一特定基因区段,抗体基因的组合形式多为单链抗体。抗体库技术的载体:噬菌体载体具有噬菌体和质粒的共同特点。 2021/7/18 星期日淘筛、表达与鉴定淘筛:抗原固相化后,对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增,与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库,反复使目的克隆大量扩增。表达与鉴定:目的克隆经过鉴定后,再导入感受态菌,进行可溶性表达。 2021/7/18 星期日噬菌体抗体库技术2021/7/18 星期日噬菌体抗体库的分类2021/7/18 星期日噬菌体展示技术2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日噬菌体抗体库技术的特点模拟天然全套抗体库避开了人工免疫和杂

5、交瘤技术可获得高亲和力的人源化抗体。2021/7/18 星期日噬菌体展示技术最关键的优势2021/7/18 星期日噬菌体抗体库技术的优势2021/7/18 星期日单克隆抗体杂交瘤技术和噬菌体抗体展示技术比较2021/7/18 星期日基因工程抗体的表达 原核生物:大肠杆菌,分 融合表达和分泌表达;真核生物:都是分泌表达,有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌。转基因植物: 烟草转基因动物:单基因水平。2021/7/18 星期日抗体在体外人源化存在的问题操作过程复杂成本高抗体的亲和力降低抗体不是人体免疫系统自然产生异源抗体与免疫系统的配合2021/7/18 星期日 最理想的单克隆抗体:100人源化

6、,由人体免疫系统自然产生。全人抗体的理论基础:癌症、病毒、细菌对机体而言均为异己物;人体不断受异己物攻击,但免疫系统通常有清除能力;免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物做出反应;体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体。全人抗体面临的关键问题:持续分泌抗体的人B细胞、抗体分泌细胞的保持。2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日五、抗体诊断试剂抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反

7、应。在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用,可作为药物用于治疗;在体外可发生凝集或沉淀等反应,可用已知抗体来鉴定抗原,作病原学的诊断和血型测定。2021/7/18 星期日抗体诊断药物分类 三类: 血清学鉴定用的抗体类试剂 免疫标记技术用的抗体类试剂 导向诊断药物2021/7/18 星期日血清学鉴定用的抗体类试剂 血清学鉴定 是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型,主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用凝集反应。2021/7/18 星期日鉴定病原菌的抗体试剂用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异;鉴定细菌的种型和亚种,这是传统血清法或动物免疫幅所做不到的,而且诊断异常准确。

8、还可以检查出某些还尚无临床表现的极小肿瘤病灶,检测心肌梗死的位置和面积,为有效治疗提供方便。2021/7/18 星期日常用品种和用途 诊断血清 分群血清 分型血清 因子血清 沙门氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清 病原性大肠埃希氏菌诊断血清2021/7/18 星期日诊断血清的制备步骤制备细菌抗原:细菌接种、培养、收集菌苔、制成菌液;免疫动物和制备抗体血清:动物有家兔、马、羊、豚鼠;免疫途径:静脉、腹腔、皮下。接种次数37次,每次间隔34天,末次注射后68天取血样测效价,达到要求,即可采血,离心分离血清。诊断血清的诊断方法:直接凝集反应2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日乙型肝炎

9、病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂 2021/7/18 星期日妊娠诊断试剂 妇女妊娠后,血液和尿液中的HCG(human chorionic gonadotrophin,人绒毛膜促性腺激素)含量增高,在3个月内达到高峰。此时检测尿液中的HCG,就可确定是否怀孕。2021/7/18 星期日抗ABO血型系统血清按照人红细胞带有的A或B种凝集原,可将血型分为A、B、AB和O型4种。ABO血型抗血清的制备:1、人源性ABO 血型抗血清是采集健康献血人的血液,凝固后,置4 度过夜,使冷抗体吸附在血块上一起除掉。2、动物源性ABO 血型抗血清是用人血型物质A 和B 免疫马得到的。3、单克隆抗体是应用B淋巴

10、细胞杂交瘤技术生产抗A 或抗B血清。血型鉴定的方法:玻片直接凝集法。 2021/7/18 星期日 2021/7/18 星期日免疫标记技术用的抗体类试剂给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性,能将抗原抗体反应放大,使常规不能观察的反应得以显现,可对微量抗体进行定性定量测定,灵敏度高。结合显微镜技术,还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外,还能为探讨发病机制提供手段。2021/7/18 星期日荧光抗体诊断试剂是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(RB200)、藻红素(PE)等标记抗体蛋白,即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞,荧光抗体就与抗原结合,

11、在显微镜下成为发光的可视物,从而达到诊断和定位的目的。2021/7/18 星期日免疫酶抗体诊断试剂用酶标记抗体来检测抗原,有免疫酶染法和酶免疫测定。目前有: HBsAg酶标诊断试剂、HBeAg酶标诊断试剂、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原) 酶标诊断试剂、测定HIV(人免疫缺陷病毒)抗原的酶标抗体诊断试剂、甲胎蛋白(AFP)酶标抗体诊断试剂、癌胚抗原(CEA)的酶标抗体诊断试剂。2021/7/18 星期日放射免疫用抗体诊断试剂 放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml,甚至pg/ml水平的微量抗原物质。2021/7/18 星期日导向诊

12、断药物以抗体为载体的导向诊断药物的研究比导向治疗更接近临床应用阶段。放射性免疫显像的优点:在体内有确切定位肿瘤的作用;在体内可检出0.5 厘米大小的病灶;小分子抗体容易到达肿瘤部位;抗体在肿瘤部位可保留6-9 日;能观察抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应。2021/7/18 星期日六、抗体治疗药物以抗体为载体的导向治疗药物研究已有20多年的历史,已制备出百余种单克隆抗体,鉴定出数十种与肿瘤有关的抗原,受试病人超过数千例。但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。在治疗药物中,单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳,但有效率仅30。目前的客观现实:研究进展迅速,但未达到常规治疗的应用阶段

13、。原因:抗体相对分子量大,穿透力低,不能达到靶部位或摄取量低;鼠源性抗体的排斥反应。2021/7/18 星期日放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体。操作简单、用量小,且能观察到药物在体内的分布和药物动力学。放射性标记的抗体有较大的杀伤范围,有利于克服肿瘤表面抗原的异质性,对肿瘤细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后的吸收作用,由于分子量小,容易穿透到达肿瘤部位。 2021/7/18 星期日抗癌药物偶联的抗体药物 常用抗癌药 氨甲喋呤、阿霉素、丝裂霉素、环磷酰胺等,以人血清白蛋白为中间载体,可明显提高每分子抗体所携带的氨甲喋呤量,使体外细胞毒性提高倍。抗体类药物的逆转耐药性 肿瘤细

14、胞对抗原药物可产生多药耐药性。 2021/7/18 星期日抗体类药物逆转耐药性肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性(MDR)。MDR是由基因调控的,其编码蛋白称为P糖蛋白,其中P170是与肿瘤耐药相关的主要蛋白,由Mdr1基因编码,1280氨基酸残基,分子量170K。认为P蛋白是ATP酶依赖性药泵,药物进入细胞后与P蛋白结合,利用ATP水解释放的能量将药物泵出胞外,使胞内药物蓄积减少,因而产生耐药性。2021/7/18 星期日毒素偶联的抗体药物 免疫毒素及其换代制品 毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B 链的完整的毒素和抗体的交联物,应用有限,第二代免疫毒素利用抗体或抗体

15、片段与毒素作用,在体内有一定的抗肿瘤作用;第三代免疫毒素重组免疫毒素,特异性好,稳定性强,渗透性好,免疫原性低,可大量制备。2021/7/18 星期日免疫毒素的制备 来源:主要是细菌毒素和植物毒素。载体种类:小分子抗体FV和SCFV;细胞生长因子可与细胞膜上的受体结合;激素,可识别细胞表面的受体;CD4可识别HIV表达的糖蛋白。先克隆出细胞基因,再利用基因重组技术去除毒素中非特异性结合部位基因,经过改造的毒素基因再与载体基因的互补DNA 重组,转入受体菌中表达,形成融合蛋白,再经纯化可得到重组的免疫毒素。2021/7/18 星期日免疫毒素的临床应用 可用于治疗肿瘤、自身免疫病、并能克服组织移植

16、排斥反应。可单独给药也可包裹在脂质体及其他微粒中给药,在胞浆物质代谢中发挥作用。对分子量小,渗透力强、效果好。 2021/7/18 星期日单克隆抗体生产工艺实例 抗HBsAg的单克隆抗体生产工艺抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)单克隆抗体是专一性识别HBsAg 的单一抗体,能与HBsAg 产生免疫反应。 临床上用于检测乙型肝炎病毒的感染并用于生产预防乙肝的免疫制剂。目前生产抗HBsAg的单克隆抗体技术有基因工程与细胞工程。2021/7/18 星期日 免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨髓瘤的IR983F 细胞融合技术制造抗HBsAg单克隆抗体的工艺。2021/7/18 星期日工艺流程 大鼠骨髓瘤细胞免疫大

17、鼠脾淋巴细胞融合混合物杂种细胞混合物杂交瘤克隆系细胞种质培养液粗制McAb层析液浓缩液 McAb精品2021/7/18 星期日工艺过程 培养基 大鼠骨髓瘤IR983 F 细胞系的培养基为改良的DMEM培养甚。是使Eagle培养基中15 种氨基酸浓度增加l 倍,8 种维生素浓度增加3 倍而成,用于细胞培养,提高了细胞生长效果。 其中尚需10%灭活小牛血清,1%非必需氨基酸,0.1molL 丙酮酸钠,1%谷氨酰胺及50mgmI 庆大霉素;杂交瘤细胞筛选系统用含HAT 的DMEM 培养基。 2021/7/18 星期日 饲养细胞制备: 在细胞融合前23 天,取健康大鼠处死,向腹腔内注入10mlDMEM

18、 培养液轻压腹腔使细胞悬浮,打开腹壁皮肤,暴露腹膜,提起腹膜中心,插入注射针头,吸出全部细胞悬液,500g 离心5min,用pH7.4,0.1molL 磷酸缓冲液洗涤2-3 次,收集细胞,用含10小牛血清、100Uml 青霉素和链霉素及HAT 的DMEM 培养液制成106 细胞ml 悬浮液,使用24 孔板时,每孔加0.1ml,当使用96 孔板时,则制成2x105 细胞ml 的悬浮液,每孔加0.1m!,然后置37的CO,培养箱中温育,备用。 2021/7/18 星期日 亲本细胞准备: 取对8氮鸟嘌呤抗性的Louc 大鼠非分泌型浆细胞瘤IR983F 细胞,用常规方法制成细胞悬浮液,按1.5x105

19、 细胞 ml 接种量接种于DMEM 培养液中,于37CO2 培养箱中培养至对数生长期,经常规消化分散法用DMEM 培养液制成细胞悬浮液,即为待融合用骨髓瘤细胞亲本,备用。 另取HBsAg 用pH7.4,0.1molL 磷酸缓冲液溶解并稀释成20gml 的溶液,加等体积福氏完全佐剂充分乳化后,取2ml 注入Louc 大鼠腹腔,2 周后进行第2 次免疫,3 个月后于融合前34 天进行加强免疫 。2021/7/18 星期日 于细胞融合前处死大鼠,用碘酒棉球及酒精棉球先后对右上腹部消毒,剖开腹部,用无菌剪刀与镊子取出脾脏,用pH7.4,0.1molL 磷酸缓冲液洗去血液,在无菌烧杯或培养皿中切成1mm

20、3 小块,再用磷酸缓冲液洗涤34 次,直至澄清,倾去洗涤液,加入组织块56 倍体积(质量体积)的0.25%胰蛋白酶溶液(pH7.67.8)于37 度保温,消化20 一40min,每10min 轻摇消化瓶1 次,直至组织块松软为止,倾去胰蛋白酶溶液,再用上述磷酸缓冲液洗涤35 次,然后加入少量磷酸缓冲液用10ml 吸管吹打分散,至大部分组织块分散为细胞,用两层无菌纱布过滤,未分散的组织块再加少量磷酸缓冲液吹打和分散,合并细胞滤液,离心收集细胞并用磷酸缓冲液洗涤23 次,然后用无血清的DMEM 培养液稀释制成细胞悬浮液,即为免疫大鼠脾淋巴细胞亲本,备用。2021/7/18 星期日 固定化抗大鼠K

21、轻链单抗的制备: 载体也为Sepharose 4B,其活化方法与制备固定化t-PA 相同。取30g 活化的Sepharose 4B 悬浮于100ml,pH10.2,0.025mol/L 硼酸缓冲液中,另取1g 抗大鼠K 轻链的McAb(MARK-1)溶于25ml 硼酸缓冲液,然后加至上述已活化的Sepharose 4B 悬浮物中,于10 度搅拌反应1620h,将其装柱(直径2cm*50cm)并用10 倍柱床体积(体积体积)的上述硼酸缓冲液以56mlmin 流速洗涤柱床,收集流出液,测A280 并根据流出液计算偶联效率然后依次用5 倍柱床体积(体积体积)的pH10,0.1mol/L 乙醇胺溶液及

22、pH8.0,0.1molL 硼酸缓冲液充分洗涤最后用pH7.4,0.1mo/L 磷酸缓冲液洗至流出液A280 小于0.01,即得抗HBsAg McAb 的亲和吸附剂,将其转移至含0.01NNaN3 的pH7.4,0.1mol 磷酸缓冲液中,于4贮存,备用。2021/7/18 星期日 细胞融合: 取107 个IR983 F 细胞与108 个免疫大鼠脾淋巴细胞于50mi 离心管中,混匀,在4 度下,1500rmin 离心810min,用巴斯德吸管小心吸去上清液,轻弹管底,使沉淀的细胞松动,于37 度水浴中保温,并于lmin 内轻轻滴加0.8ml 50%PEG4000,同时用吸管尖轻轻搅动6090s,然后于2min 内缓慢滴加20mlDMEM 培养液,1500rmin 离心810min,吸去上清液,然后再用含20%小牛血清的DMEM 培养液稀释至50ml,制成细胞悬浮液,得细胞融合混合物。 2021/7/18 星期日 杂交瘤细胞筛选: 筛选产生抗HBsAg 单抗的杂交瘤细胞的方法是用AUSAB 酶免疫试剂盒测定表达抗体的细胞,即将包被了人HBsAg 的聚苯乙烯珠与待测杂交瘤培养上清培育,然后用磷酸缓冲液洗涤34 次,加入用生物素偶联的HBsAg 培育后洗涤,再加过氧

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