分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性

1、蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。【实验原理】蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。UDPG+果糖蔗糖+UDP这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L）,细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD,测定果糖

2、含量表示酶活性）。蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：UPDG+F6P-蔗糖-6-P+UDP+H+6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。实际上最近有证据证明SPS和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，

3、在480nm处可比色测定。【实验材料】植物茎【仪器设备及设备】冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg）,0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱【试剂药品】1.提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl（PH7.0）缓冲液，内含5mmol/LMgCl2,2mmol/LEDTA-Na2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP）,2%PVP,5mmol/LDTT。lmol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液【配制方法】用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮

4、存于-20C。2透析缓冲液：25mmol/LTris-HCI（PH7.0）缓冲液，内含2.5mmol/LMgCI2,1mmol/LEDTA-Na2,1%乙二醇，1mmol/LDTT。3.酶反应液：100mmol/LTris-HCl（PH7.0）缓冲液，内含10mmol/L果糖（10mol/L果糖-6-磷酸代替果糖）2mmol/LEDTA-Na2,5mmol/L醋酸镁，5mmol/LDTT。5mMTris-HCl配法：50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与45.7毫升0.1M盐酸混匀后，加水稀释至100毫升。这是pH7.1的您要7.0的话便再加一些HC1用pH计调到7.0。.50mM

5、NaClpH=7.0配法：端直称2.92gNaCl,加水到1L然后用0.1M盐酸或者0.1MNaOH调pH至到7.04.10mmol/LUDPG:称取0.012206gUDPG，配成2ml，浓度计为10mol/LUDPG,随配随用。尿苷二磷酸葡萄糖5.2mol/LNaOH6.30%HCl7.0.1%间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml95%乙醇中，棕色瓶保存。8.1mg/ml蔗糖标准液【方法步骤】1酶液制备：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4度透析过夜，期间更换透析液

6、3次，透析后酶液定容5ml备用。2蔗糖合成酶活性测定：取3支10ml具塞试管，加入0.4ml酶反应液，0.1mlUDPG和0.05ml透析后的酶液，补水至1ml,于30度水浴中反应10分钟后，沸水浴3min中止反应，对照用蒸馏水代替UDPG。3蔗糖含量测定：往各反应试管中加入2mol/LnaOH0.1ml,沸水浴10min后，冷却至室温。加30%HCI3.5ml,0.1%间苯二酚1ml,摇匀后于80度保温10min,冷却后480nm处比色,测定蔗糖生成的量。4蔗糖磷酸合成酶反应：在酶反应液中用10mol/L果糖-6-磷酸代替果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法测定。5标准曲线制作：取7支10ml具塞

7、试管，并按下表加入各种试剂，按上述步骤3反应并测定其吸光度。以吸光度值为纵坐标，蔗糖含量为横坐标，绘制标准曲线，以计算反应中蔗糖形成的数量。管号试剂12345671mg/ml蔗糖标准液00.10.20.40.60.81.0ml)蒸馏水（ml）1.00.90.80.60.40.20蔗糖含量（mg）00.10.20.40.60.81.0A4806结果计算：蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活力单位均为mg蔗糖/（g*FW*L）酶活力（mg蔗糖/（g*FW*L）=C*Vt*n/（FW*t*Vs）式中：C是从标准曲线查得的蔗糖量（mg）；FW是样品鲜重（g）;t是反应时间（h）；Vt是提取酶液总体积（ml）；

8、Vs是测定时取用酶液体积（ml）；n是提取液测定中的稀释倍数。【注意事项】透析袋不可装满，以防止吸水涨破。蔗糖是重要的光合产物，为植物体内运输的主要物质，又是碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶（SS）、（SPS）是植物体内催化其合成的两种酶。这两种酶在生物体内的功能有所不同。蔗糖合成酶（SS）以游离果糖为受体，蔗糖磷酸合成酶（SPS）以果糖-6-磷酸为受体。后者形成的蔗糖磷酸，在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系统。UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供体，故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸

9、化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。蔗糖的合成（二条途径）：1、蔗糖合成酶（非光合组织）UDPG+果糖一蔗糖+UDP2、磷酸蔗糖合成酶（光合组织）UDPG+F-6-P-磷酸蔗糖+UDP磷酸蔗糖+H20-蔗糖+Pi、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L,pH7.5)缓冲液，包括50mmol/LMgCI；22mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml95%乙醇中。30%盐酸、2mol/LNaOH、100mmol/LUDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmo

10、l/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉)，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，力口3mlHepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000Xg离心10min。HEPES分子量为238.31，化学名：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，分子式:C8H18N2O4S2、酶活性测定依次加入50UL粗酶液，50卩LHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20uL50mmol/LMgCI，220uL100mmol/LUDPG，20uL100mmol/L6-磷酸果糖(20uL100mmol/L果糖)，30C中反应30min后，加入200uL2mol/LNaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml30%盐酸和0.5ml0.1%间苯二酚，摇匀后置于80C水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。同时取50uL粗酶液，加入20