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文档简介

1、Real Time PCR检测方法原理嵌合荧光染料检测法（SYBR Green I）SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体 系中的SYBR Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增 量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。具体原理见下图。嵌合荧光染料法原理图 TaqMan探针法TaqMan探针法是使用5端带有荧光物质（如：FAM等），3端带有淬灭物质（如:TAMRA

2、等）的TaqMan探针进行荧光检测的方 法。当探针完整时，5端的荧光物质受到3端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5端的荧光物质 便会游离出来，发出荧光。当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5一3Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度， 可以达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见下图。*引物退火/探钉与模根的杂壹TaqMan探针法原理图 CycleavePCR 法原理CycleavePCR法是由R

3、NA和DNA构成的杂合Cycling探针与RNase H组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出目的 基因。Cycling探针内部夹有RNA部分，一端标记荧光物质，另一端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用 抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光 物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。如果探针的RNA部分与模板不匹配，RNase H就不能在RNA部分将探针切断，所以该检出方法是一种即使一碱基不同也能识别 的高特异性检出方法，特别适合于SNP解析。Cycling探针碱基数少，一

4、般为十二个碱基左右，荧光报告基团和淬灭基团的距离近，淬灭效果好，荧光背景低，信噪比高。具体 原理见下图。Cycling 探针Frinqr淳天物质HE1德弯性2引物退火，探针与模板的杂变3 RNase H切断和A部分Pntymragt4发出萤光Cycling探针法原理利用CycleavePCR法的SNP解析原理CycleavePCR法在SNP分型解析方面具有强大的优势。使用CycleavePCR法进行SNP解析，在设计探针时，把多型位点或与 其相邻的第2 3个碱基设计成RNA，使用不同的荧光物质分别标记野生型和突变型探针，通过对两种不同荧光物质进行双通道同 步检测，实现对每个检测样品的SNP位点的基因型判定。SNP Point模板

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