TIMP4基因的克隆、原核表达及活性测定

1、TIMP-4基因的克隆、原核表达及活性测定【摘要】目的:接纳RT-PR法猎取TIP-4基因，并通过原核表达猎取具有生物活性的TIP-4交融卵白。要领:从SD大鼠心肌构造中提取总RNA，使用RT-PR法扩增出TIP-4基因，经基因序列阐发后构建表达载体PET-28a(+)-TIP-4，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导TIP-4的表达。使用N2+-NTA纯化和复性后，按照其骨血瘤细胞迁徙本领的影响检测其活性。效果:克隆到编码序列完全准确的大鼠TIP-4基因，能在大肠杆菌中得到高效表达，表达产物占全菌总卵白的23.5%，N2+-NTA纯化和复性后，纯度达90%以上。纯化后的交融卵白使骨血瘤细胞株的

2、迁徙本领得到明显按捺。结论:通过基因克隆和原核表达的方法可以大量得到具有生物活性的TIP-4交融卵白。【关键词】TIP-4基因克隆基因表达免疫活性Keyrds:TIP-4;genelne;expressin;viabilityassay如今对恶性肿瘤的治疗尚缺乏非常有用的方法，其重要缘故原由在于肿瘤具有侵袭、转移和基因变异等特性，对肿瘤侵袭转移机制方面的研究成为肿瘤治疗的关键。构造基质布局的粉碎和肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长、转移得以实现的先决条件。基质金属卵白酶atrixetallprteinase，P为一类卵白水解酶家属，它能落解多种胶原卵白、纤维毗连卵白和弹性卵白等血管基膜和基质布局，为

3、肿瘤的生长、转移制造符合的情况。金属卵白酶构造按捺剂tissueinhibitrfatrixetallprteinase，TIP的创造是肿瘤研究上的一大打破，它是P的自然按捺剂，如今按照创造的时间挨次别离称为TIP14。国表里对付TIP-4的成效已经有了一些研究，但效果有所差异。Jiang等1的研究创造，TIP-4可以按捺乳腺癌细胞的凋亡，而更多的实行表白TIP-4为肿瘤生长的按捺因素2，3。为进一步开展对TIP-4在骨血瘤和软骨血瘤方面的作用及其机制的研究，以及对其在其他范畴的成效，本实行接纳分子生物学的基因克垄表达和纯化等本领，力图猎取具有生物活性的TIP-4交融卵白，为以后的研究打下基矗

4、1资料和要领1.1质料1.2要领上游引物：5TGGAATTATGTGGGAGT3ERI卑劣引物：5GAAAGTTGATATTGGTATG3HindIII取逆转录产物2.0l为模板，按通例PR反响条件，先将样品于94变性5in，参加2.5u的PyrbestDNA聚合酶，按以下参数循环35次：94变性1in，58退火1in，72延伸40s，末了一个循环后，72延伸10in，4保存。直接在Ni2+-NTA柱上复性5。先用10倍柱体积的复性缓冲液A洗涤，再用15倍柱体积的复性缓冲液B洗涤。末了用洗脱缓冲液洗脱目的卵白。纯化的TIP-4经卵白质浓度测定后，-70保存。esternblt阐发区分：用10%

5、丙烯酰胺凝胶举行SDS电泳(每孔加TIP-4纯化交融卵白20l)，电泳后将卵白转移至硝酸纤维膜上，切取条带后在4条件下以的TIP-4单克隆抗体(1:100Siga)孵育24h，漂洗后以带有辣根过氧化物酶的二抗37孵育30in，4-氯-1-萘酚Siga显色。1.3统计学处置惩罚要领接纳t查验举行统计查验。2效果2.1TIP-4基因的得到新生4dSD大鼠心肌细胞构造总RNA，经甲醛变性电泳，紫外检测仪下可见齐备的28s，18srRNA，表白提取的总RNA质量可靠，未出现落解。RT-PR扩增得到巨细约680bp的特异条带，巨细与猜测效果同等见图2。接纳此片断平端克隆入载体pBSK(+)，转化感觉态T

6、G1，挑取重组子，经ERI和Hind双酶切断定，琼脂糖电泳见图3，表白插入片断巨细与猜测巨细同等。对重组质粒中插入片断测序，效果表白分散的TIP-4基因序列与GeneBank(gi:48255910)颁发的序列同等。2.2TIP-4的诱导表达、纯化及复性接纳IPTG诱导表达后创造，在分子量约23kD处有明显的卵白表达条带，该卵白巨细与理论盘算值根本同等，凝胶主动扫描阐发表现，其占BL21细菌总卵白的23.5%，根本是以包容体情势存在。将大量诱导的BL21细菌超声破裂、洗涤、溶解、纯化、复性后，经SDS电泳，考马斯亮蓝染色阐发，除TIP-4特异条带外，根本无其他条带，薄层扫描效果可见纯度达90%

7、以上，详见图4、图5。颠末esternblt阐发后表现所获得的卵白质与TIP-4抗体具有特异性作用，为TIP-4卵白见图6。2.3TIP-4的活性测定atrigel颠末重修后在聚碳酸酯膜外貌形成雷同自然基底膜布局，对其的侵袭本领可以表现出肿瘤细胞的侵袭力。本研究中表现，TIP-4交融卵白使骨血瘤细胞侵入基底膜本领受到显着影响，浸入的细胞数为61.35.2比较组为80.57.6，其按捺率到达25.1%(见表1)。3讨论TIP-4是1996年JhnGreene等7接纳已表达序列标记(expressedsequenetag，EST)序列测定的要领研究P的按捺物TIP时创造的，属于TIP家属成员中的一

8、员，按照创造的先后挨次而被定名为TIP-4。厥后通过免疫组化、Nrthen-Blt，RT-PR及原位杂交等要领来研究创造，TIP-4的构造表达相政府限，在肾脏、胰腺、结肠及直肠中的表达量非常低，在肝脏、脑、肺、甲状腺、小肠等构造中根本无表达，但在心脏有大量的转录和翻译。鉴于此，我们选择用成熟SD大鼠的心肌细胞作为基因的构造泉源，参考GeneBank(gi:48255910)颁发的序列，应用DNAstar生物软件方案引物，用RT-PR要领分散到了TIP-4目的基因，经序列测定表现分散得到的TIP-4目的基因与文献报道同等。这意味着在SD大鼠的心肌细胞中确实有TIP-4RNA表达，而且该研究中所接

9、纳的引物方案准确且条件符合。研究中把分散到的目的基因克隆至pET-28a(+)表达载体，以大肠杆菌BL21为宿主菌举行表达，创造在BL21中TIP-4的表达量可占全菌总卵白的23.5%，且根本上是以包容体的情势存在。由于TIP-4的N端交融了6His，以是表达产物在溶解后接纳N2+-NTA柱来纯化。本研究中接纳直接在N2+-NTA柱上举行复性，使传统的透析复性、稀释复性等要领存在的服从低、丧失量大的缺点得到了很大的落服。用得到的TIP-4卵白参加造就基中创造，TIP-4卵白对骨血瘤的侵袭力产生了较大的影响，按捺率到达25.1%，这意味着所得到的TIP-4卵白具有按捺骨血瘤侵袭本领的生物学活性，

10、从而为后续的TIP-4的布局和成效研究提供了基矗【参考文献】1蒋晓山,黄信孚,李吉友,等.金属卵白酶构造按捺物与乳腺癌转移及预后的干系J.中华外科杂志,2000,38(4):291-293.2FisherKE,PpA,Kh,etal.Turellinvasinfllagenatriesrequiresrdinatelipidagnist-induedG-prtEinandebrane-typeatrixetallprteinase-1-dependentsignalingJ.laner,2022,5(12):69.3aJ,hiarelli,KzarekarP,etal.ebranetype1-

11、atrixetallprteinaseprteshuanprstateanerinvasinandetastasisJ.ThrbHaest,2022,93(4):770-778.4萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主编.金冬雁,黎孟枫主译.分子克隆实行指南.北京:科学出书社,1999:16-87.5FrankenKL,HiestraHS,vaneijgaardenKE,etal.Puri-fiatinfhis-taggedprteinsbyibilizedhelateaffin-ityhratgraphy:ThebenefitsfrtheusefrganislventJ.PrteinExprPurif,2000,18(1):95-99.6hyeldinA,DalgardL,LuH,etal.Survivalandinva-sivenessfas