植物病原细菌学实验分析

1、植物病原细菌学实验分析实验一植物病原细菌常用培养基 的制作与灭菌1.了解细菌培养基的种类； 2.掌握常用细菌培养基的配方和制作方法；。一、实验目的 二、实验内容和操作方法 （1）配方：牛肉膏3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，蒸馏水 1000 L。(NA)：分离和培养最常用（2）配制过程：将牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 溶于蒸馏水后，调节，加入琼脂溶化后分装于三角瓶和试管。（一）培养基的配制2. Hugh和Leifson（HL）培养基：细菌的好氧性和厌氧性测定蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水 1000.0 ml 溴百里酚兰（酒精溶液

2、 1.5 ml）待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9 ml 灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d后观察记录。 好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。（1）配方：NH4H2PO4，氯化钾0.2，MgSO4.7H2，蒸馏水1000 L，溴百里酚兰（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。培养基：碳素化合物产酸试验 单糖（葡萄糖、半乳糖）；双糖（麦芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的细菌不产酸和气，有的只产酸不产气，少数植物病原细菌既

3、产酸又产气（3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。如果测定气体产生，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。产酸时培养液变黄，产碱时变蓝，产气则小玻管内培养液被部分排出，出现空隙。（2）配制过程：将NH4H2PO4、氯化钾、MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调节后加入溴百里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入）4. MR和VP试验：对葡萄糖的分解能力（1）配方：蛋白胨5，葡萄糖5，磷酸氢二钾5，蒸馏水 1000 L。（2）配制过程：将蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾溶于蒸馏水，调节 ，每管分装5mL即可。5. 硝酸盐还原（1）配方：硝酸钾1.0，蛋白胨5.0，酵母膏3.0，蒸馏水1000L

4、， （2）配制过程：将硝酸钾、蛋白胨、酵母膏称好后，溶解于蒸馏水后，调节 pH。6. 半胱氨酸培养液：测定产H2S能力（1）配方：蛋白胨10，硫酸钠0.1g，g，蒸馏水1000L。（2）配制过程：将半胱氨酸、蛋白胨、硫酸钠称好后，溶解于水中，调节 即可。7. 吲哚试验（1）配方： 蛋白胨，磷酸氢二钠，葡萄糖，蒸馏水1000L。（2）配制过程：将蛋白胨等称好后，溶解于蒸馏水，调节即可。8. 明胶液化g，蛋白胨5.0，明胶10-12%，蒸馏水1000L。（2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨溶解于蒸馏水中，调节后，将明胶溶解于此溶液中，即可分装于试管中。 9. 淀粉水解试验（1）配方： 牛肉浸膏3.0

5、 g，蛋白胨，淀粉1.5 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 L。（2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉称好后，溶解于蒸馏水中，加入称好的琼脂，待融化后调节。10. 石蕊牛乳反应 （1）配方： 脱脂牛乳1000 L ， 石蕊液（4%）15-20 mL。（2）配制过程：提前配制石蕊液（二）培养基的灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为1212030min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。明胶培养基灭菌1

6、2-15分钟。石蕊牛乳培养基间歇灭菌3次，每次通蒸汽20-30 分钟。灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。 加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到2时，水蒸气的温度升高到121，经2030min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。 操作方法和注意事项如下: 加水 打开灭菌

7、锅盖，向锅内加水到水位线。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。 装料、加盖 灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。 排气 打开放气阀。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。 升压、保压和降压 当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。 注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而

8、造成瓶内液体冲出容器之外。 干热灭菌法 通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160170维持12h。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。 1 细菌（NA）和真菌(PDA)常用培养基的配方和制 作过程有何异同点？2 试述高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。三、作业实验二 植物病原细菌的分离 和致病性测定二、实验内容和操作方法 （1）首先要选择典型、新鲜病组织;（2）以灭菌剪将病斑剪下，略带健康组织，大小约1公分左右，放在灭菌载玻片中央，加无菌水1d。加上灭菌盖玻片，静置

9、约10min左右，观察是否有云雾状自破口处涌出（一）细菌溢现象观察 （1）斑点型：如棉花角斑病。A. 剪取新鲜的典型病斑，约1cm见方。（二）植物病原细菌的分离1. 细菌悬浮液的配制（不同症状类型分离材料的选择和表面消毒）B.表面消毒：将切取的组织块在70乙醇中浸一下立即取出，然后用表面消毒剂进行表面消毒，可以采用升汞，152min或的次亚氯酸盐如漂白粉（1：9稀释液）2minC.消毒后用灭菌水洗涤3次，将病组织放在另一个培养皿的灭菌水中，剪破中心或以灭菌玻璃棒研碎病组织静置2030分钟，等细菌游出。（2）萎蔫型如茄青枯病将茎部剪成12寸长，表面用70酒精轻拭，在火焰上表面消毒，以灭菌刀纵剖，

10、选择轻微变色病部，以灭菌刀切出薄片或以解剖针挑出病健交界处组织（可以不再消毒），加灭菌水浸泡20-30分钟。如果茎部较粗，也可以在表面消毒后用解剖刀横断茎部，用夹子或手紧压茎部横断面，挤出溢脓或汁液。（3）肿瘤组织 软瘤比较容易分离；木质瘤可以磨碎后接种在向日葵、番茄等幼株上长出瘤后再分离。由于细菌位于表皮细胞和木质部之间，因此应用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在灭菌皿中实行解剖后以灭菌玻棒将其捣碎，静置浸泡24h。 （4）腐烂组织较简单，选择近病部交界处以接种环挑取少量腐烂组织，稀释。（5）种子带菌的分离选择病种子，以0.1升汞液表面消毒12min，灭菌水洗涤，再将此种子在70酒精中

11、浸几分钟，洗涤23次，取出放在研钵中磨碎，离心取上清液。 2. 分离方法A.倒平板：注意培养基的温度不能太高，否则冷凝水太多，细菌在水中游动而影响单个分散菌落的形成。 （1）平板划线分离法：被普遍采用B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液，在已凝固的平板培养基表面划线 如果菌液浓度大，培养皿转动角度减小，增加划线的次数划4条线后，将接种环灭菌，培养皿转动90，从第2条线开始划45条线（2）培养皿稀释分离法0原液1取1环菌液0.5L灭菌水2混匀后取1环3混匀后取1环4混匀后取1环5混匀后取1环3.培养一般放置在 2830温箱中倒置培养，时间23 d。将冷却至45左右的培养基倒入装有稀释菌液的培养皿中

12、，轻轻转动培养皿，使菌液和培养基混匀，待其凝固后培养。4.细菌的纯化 挑取分离出的典型单菌落平板划线培养（2皿），如此重复12次，最后，在均匀一致的平板中，挑取典型菌落移植在斜面培养基上培养，长成后在4环境中保存菌种。1. 配制107-108CFU/mL的细菌悬浮液，菌龄48小时左右；（二）致病性测定 2. 指示植物的选择：一般用烟草，在假单胞和黄单胞菌属上较适用。3. 接种方法：用注射器将细菌液从烟草下表皮注入叶肉细胞间。用灭菌水作阴性对照，同属HR阳性的菌株作阳性对照。4. 培养条件：接种后的植物应保持在25，相对湿度较高（85%）的条件下。5. 结果观察：在2448h表现枯斑为阳性反应，

13、3d左右出现黄斑为阴性反应。三 作业：1.简述本实验中植物病原细菌的分离步骤及其操作注意事项2. 烟草过敏性反应试验能够确定细菌的致病性吗？为什么？实验三植物病原细菌的形态观察1.了解革兰氏染色鉴定的快速鉴定方法；2.掌握革兰氏染色和鞭毛染色的方法；3.掌握细菌培养性状的描述特征。 一、实验目的 二、实验内容和操作方法 （一）革兰氏染色 （1）试剂A. 结晶紫草酸铵染剂：溶液：g，酒精（95%）20mL 混合溶液和，过滤，贮藏于试剂瓶中，24h后使用。溶液：g，蒸馏水80mLC.复染剂原液：番红O 2.5g，95%酒精100mL复染剂：原液10mL，蒸馏水90mLB. g，碘化钾2g蒸馏水30

14、0mL。 将碘和碘化钾在研钵中研和，慢慢加水并继续研和直至碘和碘化钾溶解，然后加水稀释到300mL，盛入棕色试剂瓶，放暗处备用。（2）染色程序A. 配制细菌悬浮液：菌龄16hB. 在干净的载玻片上涂片、风干，不要加热，然后在火焰上通过2次，固定玻片。C. 结晶紫染色1分钟，水洗数秒钟，吸干。D. 碘液处理1分钟，水洗，吸干。E. 用95%酒精褪色约30秒。水洗，吸干F. 番红O复染10秒，水洗，吸干G. 加1滴香柏油，在油镜下镜检，红色为革兰氏阴性菌，紫色为革兰氏阳性菌。2.氢氧化钾溶解试验（1）试剂：3氢氧化钾（2）方法：取12滴3氢氧化钾溶液置于干净的玻片上，用牙签取新鲜细菌培养物与氢氧化

15、钾混合，充分搅拌1020秒，如果液滴变粘稠并可拉出丝状物体，表示测试菌为革兰氏阴性菌，反之则为革兰氏阳性菌。（二）鞭毛染色（西萨基尔法） （1）媒染剂：单宁酸10g，ALCL3.6H2O 18g，ZnCL2 10g，g，60%酒精40mL 在研钵中加入酒精和上述各种成分，充分研磨后，再加入其余的酒精。使用前用蒸馏水稀释2倍，染色时过滤，滤液直接滴在涂片上。溶液：g，酒精（95%）10mL 溶液和分别配制后混合。溶液：苯酚（结晶）5g，蒸馏水95mL（2）染液：2. 染色步骤（1）载玻片准备：选用新的或没有伤痕的，先用洗洁精浸泡洗涤，用清水洗净后，再放入酸酒精（硫酸与酒精等量混合）中浸泡24-4

16、8h，取出后用清水洗净，再用蒸馏水洗，沥干水后，浸泡在95%酒精中备用。（2）配制细菌悬浮液，菌龄很重要，一般适温培养16-24h。用吸管沿试管壁缓缓加入无菌水5mL，静置30分钟左右，配成菌悬液。（3）涂片：取浸在酒精中的载玻片，在火焰上烧去酒精，平放，用吸管吸取细菌悬浮液（以上层为好）在载玻片的一端滴一滴，然后将载玻片稍稍倾斜，使菌悬液从一端缓缓流向另一端，使涂片自然风干。（4）媒染剂过滤后，直接将滤液滴在涂片上，处理5-7分钟（5）用水轻轻洗去染媒剂，甩去载玻片上剩余的水，在空气中干燥后，再加苯酚品红染剂染色5分钟。（6）水洗，在空气中干燥后，加1滴香柏油，在油镜下观察鞭毛的数量和着生位

17、置。1.革兰氏染色反应和鞭毛染色在植物病原细菌鉴定中有何作用？为什么？2.细菌鞭毛染色对菌龄的要求比较严格，在操作过程中也要注意动作的轻柔，为什么？3 观察和记录NA平板上的细菌菌落性状、菌体形状、运动性和革兰氏染色结果。三 作业实验四 植物病原细菌生理生化测定1. 掌握无菌操作技术；2. 了解各种生理生化性状测定常用试剂的配制方法；3. 掌握各种生理生化性状的观察方法。 一、实验目的 二、实验内容和方法 1.产酸和产气试验（一）碳素化合物的利用1）接菌培养：一般每5 mL培养液接种0.1mL 108 CFU/ml菌悬液，适温下培养3-4周。2）结果观察：产酸：培养液变为黄色产碱：培养液变为蓝

18、色CK：培养液为草绿色变色产气：杜氏发酵小玻管出现空隙CK：杜氏发酵小玻管不出现空隙产气（1）配方：NH4H2PO4，氯化钾0.2，MgSO4.7H2，蒸馏水1000 L，溴百里酚兰（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。Ayers培养基：碳素化合物产酸试验 单糖（葡萄糖、半乳糖）；双糖（麦芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的细菌不产酸和气，有的只产酸不产气，少数植物病原细菌既产酸又产气（3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。测定气体产生时，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。（2）配制过程：将NH4H2PO4、氯化钾、MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调节后加入

19、溴百里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入） 3）MR试验结果观察：取上述培养液5ml，加甲基红试剂23滴，呈明显红色为阳性，呈黄色为阴性。2.甲基红(MR)和VP(产3-羟基丁酮)试验1）接菌培养：一般每5mL培养液接种8CFU菌悬液，适温下培养1周。2）甲基红试剂配制：甲基红溶解于300ml的95%酒精中，然后用蒸馏水稀释至500ml。 4）VP试验结果观察：每毫升加0.1mL40%KOH溶液, 置48-50水浴处理2h，充分摇动后观察结果。在4h内出现红色者为阳性反应。 测定亚硝酸，每试管加试剂A和试剂B各1ml如呈红色，表示有亚硝酸根。1）接菌：在培养液中接菌后培养1周（二）氮

20、素化合物的分解2）Griess-Llosvary试剂测定法 试剂A：对氨基苯磺酸，5mol/L醋酸（冰醋酸加水）1000ml 试剂B：二甲基-萘胺6ml，5mol/L醋酸1000ml1.硝酸盐还原1）醋酸铅滤纸条的制备：将滤纸剪成5mm50mm的小条浸在5%醋酸铅溶液中，空气中干燥后，在120烘箱中灭菌1h。2）接菌：将细菌接种于试管中的培养液中后，用上述制备的滤纸条夹在棉花塞和试管壁之间，使纸条悬在培养液面上，但不要碰到培养液，25培养2周。3）结果观察：纸条变黑表示有硫化氢产生，为阳性反应。2.硫化氢产生1）草酸滤纸条的制备：将滤纸剪成5mm50mm的小条浸在饱和草酸溶液中，空气中干燥后，

21、在120烘箱中灭菌1h。2）接菌：将细菌接种于试管中的培养液中后，用上述制备的滤纸条夹在棉花塞和试管壁之间，使纸条悬在培养液面上，但不要碰到培养液，适温培养1周。3）结果观察：纸条变淡红色表示有吲哚产生，为阳性反应。3.吲哚产生1）接菌：采用穿刺法接菌后，放在适温中培养1-3周。以不接菌试管为对照。（三）大分子化合物的利用2）结果观察：将经过培养的接菌试管取出后，放在4冰箱中，看其是否凝固，如不凝固，则说明明胶分解而导致液化，为阳性反应。1.明胶液化A.酸的产生：石蕊牛乳变成粉红色，表示从乳糖产酸1）接菌：将培养基接种细菌于28培养1-3周，以不接种的石蕊牛乳做对照。2）结果观察：2.石蕊牛乳

22、反应B.凝固：产酸达到发生凝块，如产气凝块断裂； 凝乳酶的作用而凝固，凝块收缩与乳清分离。C.胨化：牛乳变清，往往从表层开始D.碱的产生：石蕊牛乳变蓝色，胨化时常呈碱性E.石蕊还原：石蕊变为无色 在平板上加碘液后，培养基为深兰色，菌落周围有无色透明圈者为阳性。1）接菌：将细菌接种于淀粉琼脂平板上，适温下培养24-48小时。2）结果观察：3. 淀粉水解试验四、细菌的好氧性和厌氧性测定蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水 1000.0 ml 溴百里酚兰（酒精溶液 1.5 ml）待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9 ml 灭菌。培养基

23、凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d后观察记录。 好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。1）试剂：1%二甲基对苯二胺盐酸盐或1%四甲基对苯二胺盐酸盐。（五）其他生理生化试验2）测定方法：1.氧化酶试验A. Kovacs：在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3-4滴试剂使其湿润，用牙签挑取24h菌苔涂在滤纸上，60秒内变成紫色为阳性反应，60秒后或不便色为阴性。B.滤纸条法：用滤纸条蘸少许菌苔，加1d试剂，立即呈粉红色为阳性1）试剂：3%过氧化氢2）测定方法：挑取固体培养基上培养24

24、-48h的菌苔，置于干净玻片上，滴加过氧化氢。2.过氧化氢酶（接触酶）试验3）结果观察：在半分钟内有大量气泡产生的为阳性，不产生气泡的为阴性。三 作业：1 若有吲哚和硫化氢产生，其实验的试管口上的滤纸条会发生什么样的颜色变化，为什么？2 在石蕊牛乳不能和其他细菌培养基一起灭菌，为什么？反应中会出现多种不同的反应，试分析其发生的原因？ 3 观察和记录细菌氧化发酵试验、MR试验以及接触酶试验结果。实验五 植物病原细菌的PCR分子鉴定 1 了解PCR反应的原理；掌握PCR反应的操作方法。一、实验目的 二、PCR扩增 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）1、

25、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循

26、环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2 The procedure of PCR5533d.NTPsTaqPrimers5353535353535353componentdenaturation535353535353(94) extension53535353353TaqTaq55repeatedanneal(72) (50) 53535353553353532 cycles4 copies3 cycles8 copies535353535353535353535

27、3355353535310反应缓冲液（含Mg2）5.0 ldNTP混合物，10 mmol/L1.0 l上游引物，20 mol/L1.0 l下游引物，20 mol/L1.0 l模板DNA1.0 lTaq plus DNA聚合酶，5 U/l0.5 l加双蒸水至终体积为50 l 3 反应体系 取一0.5 ml PCR薄壁管，依次加入以下试剂： M 1 2 3 43kb2kb0.8% agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160M: DNA marker; 1: Y160; 2:positive control; 3 4

28、: CK-引物量： 每条引物的浓度1umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。4 PCR反应操作注意事项：dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓

29、度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间：重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合