化学发光免疫技术----医学课件

1、化学发光免疫 分析技术内 容第一节 概述 一、发光的分类 二、化学发光产生的条件 三、化学发光效率 四、化学发光免疫技术的分类 五、化学发光免疫分析的非均相分离方式第二节 化学发光剂和标记技术 一、化学发光剂 二、发光剂的标记技术第三节 化学发光免疫分析的类型 一、直接化学发光免疫分析 二、化学发光酶免疫分析 三、电化学发光免疫分析 四、鲁米诺氧途径免疫分析第四节 化学发光免疫测定的临床应用发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、快速、 试剂无毒、安全稳定、可自动化。第一节 概 述发光:是指分

2、子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。 光照发光：指发光剂（荧光素）经能量较高的短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出能量较低的较长波长的可见光（荧光）的过程。 生物发光：指发生在生物体内的发光现象 化学发光：指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象一、发光的分类 （能量来源不同） 荧光素酶ATP；O2；Mg2+激发态氧化型荧光素萤火虫荧光素光 + AMP+ O2 + CO2 +萤火虫发光腰鞭毛虫水母深海鱼发光返 回 概念：是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应

3、时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。化学发光化学发光与荧光的区别：形成激发态分子的激发能不同关键步骤化学发光的条件反应必须提供足够的能量（170300KJ/mol)化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发，且有足够的光量子产率大多数化学发光反应为氧化-还原反应化学激发发光二、化学发光产生的条件(首要条件)化学发光产生的条件步骤：化学反应生成中间体；化学能转化为电子激发能使中间体变成电子激发态；激发态分子辐射光子回复到基态。直接化学发光:间接化学发光:A+BC*C*

4、 C+h.A+BC*C* +DC+D*D* D+h.三、化学发光效率发光剂在反应中的发光分子数/参加反应的分子数由发光物质的性质决定四、化学发光免疫技术的分类标记物是否需要分离是否直接发光反应模式不同标记物不同五、非均相分离方式固相分离过滤分离珠式分离顺磁性颗粒分离（首选）第二节 化学发光剂和标记技术 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物一、化学发光剂（发光底物）直接化学发光剂间接化学发光剂能作为化学发光剂的条件：发光的量子产率高；物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对

5、生物体没有毒性。 1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 直接化学发光剂-可直接标记抗原或抗体2三联吡啶钌 三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。 三联吡啶钌电化学发光剂反应原理 1、酶促反应发光剂HRP的发光底物：鲁米诺及其衍生物 ALP的发光底物：AMPPD间接化学发光剂酶 标记抗体或抗原，需酶催化后发光（1）鲁米诺（最早合成） 鲁米诺发光原理（2） AMPPD3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3

6、-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷2、酞箐、二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物通过活性离子氧传递连接的间接化学发光剂核心原理：高能态离子氧的产生和传递酞箐结构680nm激发光离子氧200nm范围内二甲基噻吩衍生物紫外光Eu螯合物激发612nm光二、发光剂的标记技术通过化学反应将发光剂连接到抗体或抗原直接偶联：通过偶联反应，使标记物分子中反应基团直接连接到被标记物分子的反应基团上. 碳二亚胺（EDC）缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法 间接偶联：用功能交联剂在标记物和被标记物之间插入一条链或一个基团，使之连接成结合物 琥珀酰亚胺活化法1. 碳二亚胺（EDC）缩合法 经缩合反应，蛋白质分子中的游离羧

7、基与发光剂中的氨基形成稳定的酰胺键用于结构中有羧基或氨基的标记物2. 过碘酸钠氧化法 用于含有芳香伯胺和脂肪伯胺的发光剂不适于无糖基的蛋白质3重氮盐偶联法 蛋白质中能偶合重氮盐的位置：酪氨酸残基的邻位酚羟基 组氨酸残基的咪唑环 色氨酸残基的吲哚环4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法 蛋白质分子中的羧基被活化后与发光剂的氨基偶联形成酰胺键 1发光剂的选择 2被标记蛋白质的性质 3标记方法的选择 4原料比 5标记率 6温度 7纯化与保存 影响标记的因素第三节 化学发光免疫分析的类型 用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-发

8、光剂标记抗体复合物，加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，化学发光剂（吖啶酯）在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成比例，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析 吖啶酯化学发光的特点 标记物：吖啶酯及其衍生物 底物： Pre-trigger（双氧水）/trigger（氢氧化钠）固相载体：顺磁性微粒 分离：电磁场YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特点抗原和抗体结合与未结合部分的易分离化学发光免疫分析反应原理（双抗体夹心法） ARCHITECT-

9、i2000化学发光微粒子免疫分析化学发光免疫测定仪 CLEIA是用参与催化某一化学发光反应的酶标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光。 由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析（CLEIA） 化学发光酶免疫分析的特点 标记物：酶（HRP、ALP) 底物(发光剂）：HRP-鲁米诺 ALP-AMPPD 固相载体：磁性微粒、塑料珠、塑料锥形小管 分离：磁场、高速离心辣根过氧化物酶标

10、记化学发光免疫分析示意图 Vitros ECi全自动增强化学发光酶免分析仪 碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 IMMULITE 1000型全自动任选式酶放大化学发光免疫分析系统Access全自动微粒子酶放大化学发光免疫分析系统 是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体,在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。 三、电化学发光免疫分析（ECLIA） 电化学发光免疫分析的特点在电极表面因电子转移而发生的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光两个部分。电化学反应： 三联吡啶钌：标记抗体/抗原 TPA（三丙胺）：电子供体磁性微

11、粒子固相亲和素- 生物素间接包被，使检测的灵敏度大大提高。样本盘型样本架型Elecsys1010Elecsys2010E170电化学发光免疫检测系统（Elecsys)电化学发光免疫分析示意图ECLIA体系结构图ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）电极表面的电化学发光反应ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）四、鲁米诺氧途径免疫分析（LOCI）均相反应模式核心原理：高能态离子氧的产生和传递两个微粒：感光珠：内含酞箐（鲁米诺类化学发光物质） 发光珠：内含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物反应基础：两种微粒相互接近的化学能量传递感光微粒在680nm激发光下能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧在200nm范围之内，发光微粒中的二甲基噻吩衍生物接受高能态离子氧产生紫外光并激发Eu螯合物，发出612nm的光。 分别包被2个抗体发射光612 nm发光微球1O2AB激发光680 nm感光微球200nm是均相反应的模式，反应时间更短；反应过程有放大效应，发光迅速，保证了测定的敏感性；整个能量（光）的产生、传递和放大过程十分稳定，不易受pH值、离子强度和温度