噬菌体（96页）

1、Bacteriophage2021/4/261噬菌体概述1 噬菌体展示技术23噬菌体载体4 细菌的检测与治疗5 噬菌体转导2021/4/262第一章 噬菌体概述分类简史概念结构特性2021/4/2631.1噬菌体概念 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒，只能在活的微生物细胞中复制增殖。2021/4/2641.1噬菌体概念噬菌体分裂中的大肠杆菌大肠杆菌电镜扫描图 2021/4/265附在细菌上的噬菌体 噬菌体2021/4/2661.2 噬菌体发展简史1896年，英国细菌学家Hankin发现了水中存在抗细菌现象，并认为有种不明物质引起了这种现象。1915年，英国Twort在葡萄球

2、菌中发 现噬菌体。1917年，加拿大人F.d，Herelle在法国巴斯德研究所又独立发现痢疾杆菌噬菌体。2021/4/2671.2 噬菌体发展简史现象：本来混浊的菌悬液经一夜振荡培养后反而变清。为了弄清原因，他把变清的培养液用细菌过滤器过滤，并把滤液滴在痢疾杆菌菌液里，奇怪的现象再次发生。他还建立了空斑滴定法，此法简单，方便准确。至今仍是定量测定噬菌体浓度的有效手段，而且为动物病毒定量滴定所借鉴，建立了病毒空斑滴定法。2021/4/2681.3 噬菌体的特性 123个体微小、可通过细菌滤器无细胞结构专性细胞内寄生分布广泛2021/4/2691.3 噬菌体的特性 裂解或不裂解细菌 456有抗原性

3、可刺激机体产生抗体能够抵抗热、低温、冰冻等2021/4/26109、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2022/7/182022/7/18Monday, July 18, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。2022/7/182022/7/182022/7/187/18/2022 10:27:52 PM11、人总是珍惜为得到。2022/7/182022/7/182022/7/18Jul-2218-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。2022/7/182022/7/182022/7/18Monday, July 18, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2022/7/18

4、2022/7/182022/7/182022/7/187/18/202214、抱最大的希望，作最大的努力。18 七月 20222022/7/182022/7/182022/7/1815、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。七月 222022/7/182022/7/182022/7/187/18/202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022/7/182022/7/1818 July 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2022/7/182022/7/182022/7/182022/7/181.4 噬菌体结构2021/4/26129、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。20

5、22/7/182022/7/18Monday, July 18, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。2022/7/182022/7/182022/7/187/18/2022 10:27:52 PM11、人总是珍惜为得到。2022/7/182022/7/182022/7/18Jul-2218-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。2022/7/182022/7/182022/7/18Monday, July 18, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2022/7/182022/7/182022/7/182022/7/187/18/202214、抱最大的希望，作最大的努力。18

6、 七月 20222022/7/182022/7/182022/7/1815、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。七月 222022/7/182022/7/182022/7/187/18/202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022/7/182022/7/1818 July 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2022/7/182022/7/182022/7/182022/7/181.5 噬菌体的化学组成核酸：头部核心，DNA或RNA 作用：噬菌体的遗传物质 蛋白质：头部外壳和尾部 作用：保护核酸 构成外壳和尾部2021/4/26141.5噬菌体的化学组成噬菌体的一些结构蛋

7、白2021/4/26151.6 噬菌体的分类按照基本形态可划分为三类： 蝌蚪状（T4）、微球状（ x174） 和丝状（M13）。2021/4/2616根据噬菌体结构的不同可将其分为：123无尾部结构的二十 面体有尾部结构的二十 面体线状体2021/4/26171.6 噬菌体的分类 迄今已知的噬菌体大多 数是有尾部结构的二十面体，到目前为止，研究者至少对5568种噬菌体进行了电镜观察，绝大多数(占96.2% )为有尾噬菌体。2021/4/26181.6 噬菌体分类按遗传物质类型进行划分： 线状双链DNA（多数）1.DNA噬菌体： 环状单链DNA（少数） 线状单链RNA（多数）2.RNA噬菌体：

8、线状双链RNA（少数）2021/4/26192021/4/26201.6 噬菌体分类2021/4/26211.6 噬菌体分类根据噬菌体与宿主的关系：（1） 烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体。（2）温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。2021/4/26221.7 噬菌体侵染细菌实验烈性噬菌体侵染细菌的过程 （1）吸附 （2）注入 （3）增殖 （4）装配 （5）裂解2021/4/26231.7 噬菌体侵染细菌实验2021/4/26241.7 噬菌体侵染细菌实验噬菌体

9、的侵染实验的结果 证明了DNA是遗传物质2021/4/26251.7 温和噬菌体与菌细胞的作用溶菌周期 溶原周期2021/4/2626第二章 噬菌体展示技术 1985年,Smith第一次成功地将EcoRI核酸内切酶基因插入丝状噬菌体基因p中,并在噬菌体表面表达出了融合的蛋白。2021/4/26272.噬菌体展示技术噬菌体？噬菌体展示技术2021/4/2628Company Logo2.1 噬菌体展示技术的发展1988 噬菌质粒系统1990 抗体片段的展示1993 展示cDNA文库1994 研发了phage two-hybrid技术1996 首次体内in vivo 淘选试验1998 噬菌体展示载

10、体作为基因导入载体1999 Combination of phage display with high-density arrays2001 Automated phage display selection2021/4/26292.2 噬菌体展示技术的原理 以噬菌体或噬菌粒为载体，将目标蛋白的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面，通过筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量富集，从而获得目的多肽或蛋白质。2021/4/2630LeadHvLinkLvEPIIIPIII基因型表达型融合蛋白2021/4/2631Company L

11、ogo2.3 噬菌体展示技术流程2021/4/26322021/4/26332.4 常用的噬菌体展示系统常用的噬菌体展示系统M13丝状噬菌体T7噬菌体T7噬菌体噬菌体T4噬菌体T4噬菌体2021/4/2634Company Logo2.5 噬菌体展示技术的优点 非展示系统 展示系统2021/4/26352.5 噬菌体展示技术的优点特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，将重组蛋白质筛选与基因筛选合二为一。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。由于丝状噬菌体易于在大肠杆菌系统中分离扩增，因此此技术又合并了选择能力和扩增能力的优势，使得噬菌体展示

12、技术成为高效的筛选体系。2021/4/2636操作简单易行，该技术采用经典的PCR分子克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选106108克隆，筛选获得抗体库可以用于原核系统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点。2021/4/26372.6 噬菌体展示技术的局限性所建库的容量和分子多样性受到限制；不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达；噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，

13、很难得到有效表达和展示。 2021/4/26382.7 噬菌体抗体库技术 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P或P相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。2021/4/26392.7 噬菌体抗体库的分类 (1)根据 免疫抗体库 插入基 因片段 非免疫抗体库 天然抗体库 的来源 半合成抗体库 全合成抗体库 第一个合成的噬菌体抗体库是Barbas等1992年报道将合成的一小段CDR3片段。 2021/4/2640Company

14、 Logo2.7噬菌体抗体库的分类（2）按抗体基因的动物来源分类鼠源性抗体库人源性抗体库驼源性抗体库2021/4/2641Company Logo从抗体库中可筛选多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术的应用潜力。2021/4/2642实例Burmester等构建了青霉素免疫单链抗体库；Yuan等从7个不同的人种,共47个健康人类的血液中提取基因,构建了人源天然单克隆抗体噬菌体抗体库2021/4/2643第三章 细菌的检测与治疗 噬菌体感染相应细菌后，迅速繁殖并产生子代噬菌体。 利用该特性可将已知噬菌体加入被检材料中，如果噬菌体效价增强，就证明被检样品中有相

15、应细菌存在。应用此原理可以对细菌进行检测。2021/4/26443.1生物扩增法 原理： 当样品中的待检细菌数目较少时，将不利于噬菌斑的形成，影响检测结果。如果加入能够被噬菌体裂解的辅助菌，被侵染的待检细菌裂解释放出来的子代噬菌体会立刻继续吸附裂解辅助菌，从而形成清晰的噬菌斑。因此根据噬菌斑的数目检测样品中病原菌的含量。2021/4/2645将待检细菌的噬菌体与样品混合，37度培养1h，仅待检细菌被噬菌体吸附侵染加入灭病毒剂灭活5min，灭活所有未侵染宿主细胞的噬菌体；将辅助菌加入到样品中，中和灭病毒剂，并立刻混合后倒入琼脂平板进行培养释放出来的子代噬菌体裂解辅助菌；平板中形成清晰可见的噬菌斑

16、。2021/4/26463.1生物扩增法 该方法的关键是选择合适的灭病毒剂，其中化学试剂硫酸亚铁铵最为常用。利用该法已成功的检测出结核杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和弯曲杆菌等。2021/4/26473.2荧光标记法原理： 荧光标记检测技术是指利用荧光染料制备荧光噬菌体，利用这种噬菌体的荧光特性来检测病原菌的方法。以食源性沙门氏菌的检测为例 鸡蛋中检测到的沙门氏菌 2021/4/2648方法荧光标记O-I噬菌体的制备与收集荧光标记的O-I噬菌体侵染宿主菌荧光显微镜观察结果O-I噬菌体液与1SYBRR染料，按101的比例混合,摇匀, 在暗处作用10 min 0.2m过滤收集荧光

17、标记的噬体,1PBS缓冲液冲洗23次除去标记噬菌体后多余的染料,最后去离子水洗涤滤膜回收噬菌体将待检样品于37静止培养6 h预增菌后，加入荧光标记的O-I噬菌体暗处侵染20min， 加入 4%多聚甲醛终止反应，0.2m滤膜过滤收集沙门氏菌阳性者均出现明显的杆状荧光，即带有荧光标记的沙门氏菌。2021/4/2649检测结果荧光标记噬菌体O-I对食品样品检测结果沙门氏菌O-I 噬菌体2021/4/26503.3与生物传感器联用检测方法原理： 根据具有专一裂解特点的烈性噬菌体能够将特异性的细菌裂解释放出胞内物质（如酶），通过生物传感器监控细菌胞内某种物质的信号变化，即可检测出致病菌。2021/4/2

18、651 利用这种方法可以在68h内检测出1CFU/100mL的大肠杆菌。与生物传感器联用的噬菌体检测技术操作简单、分析速度快，但由于生物传感器抗干扰能力差、可靠性低，生物传感器在病原体检测中的应用受到一定的限制。2021/4/26523.4应用报告噬菌体法检测致病菌原理： 应用DNA重组技术将报告基因首先插入到噬菌体DNA上，将带有报告基因的噬菌体与待检样品作用，随着报告基因在宿主菌中的表达，目标菌体便可快速得到检测。2021/4/2653含有报告基因的噬菌体宿主菌2021/4/2654常用的报告基因有： 绿色荧光蛋白基因(gfp)2 细菌荧光素酶基因(lux)1 -半乳糖苷酶基因(lacZ)

19、3带有荧光素酶基因(lux)的噬菌体在体外不发光，但当该噬菌体吸附侵染宿主细菌后，发光基因得以表达，因此，噬菌体在宿主细胞体内可以发光。含有gfp基因的噬菌体侵染特定的宿主菌后，该基因在宿主菌中表达并产生绿色荧光蛋白，再用荧光显微镜观察即可检测待检样品中有待检菌。2021/4/2655检测实例 E.coli用以上三种基因均可进行检测2021/4/2656噬菌体治疗 噬菌体对一些细菌具有高度的专一性,当噬菌体侵染细菌时,可在细菌中繁殖并杀死细菌;而它对动植物没有毒性。根据噬菌体的这一特性可对细菌性疾病进行治疗。2021/4/2657早期噬菌体治疗1917年加拿大微生物学家Herelle在田野中进

20、行了噬菌体治疗鸡沙门菌感染的研究，并获得了成功。1919年1921年Herelle在巴黎医院给一个患有痢疾的男孩实施抗痢疾噬菌体治疗,治疗后病人的症状消失并康复。Bruynoghe和Maisin将噬菌体注射到外科手术伤口部位,治疗了葡萄球菌的感染。2021/4/2658噬菌体治疗感染的近期研究 3例确诊为结核性口腔溃疡患者采用分枝杆菌噬菌体软膏涂抹，均在1周内开始愈合，24周全部愈合。刘晓彬等应用噬菌体治疗肠源性铜绿假单胞菌感染的动物模型，有明显的治疗作用。Matsuzaki等采用噬菌体 MR11治疗金黄色葡萄 球菌的感染。2021/4/2659噬菌体治疗范围 噬菌体治疗敏感性致病菌的范围相当

21、广泛，如葡萄球菌属细菌、埃希菌属细菌、克雷伯菌属细菌、变形杆菌属细菌、假单胞菌属细菌、弧菌属细菌、放线菌属细菌、分枝杆菌属细菌等。 治疗的疾病包括化脓性伤口感染、胃肠炎、脓毒症、骨髓炎、皮炎、脓胸、肺炎、脑炎、细菌性腹水、痢疾和霍乱等。2021/4/2660噬菌体制剂 活噬菌体制剂1 噬菌体尾部样细菌素1 裂解酶制剂2是双链DNA噬菌体在自身复制晚期合成的一类细胞壁水解酶，能作用于细菌细胞壁的肽聚糖,破坏细菌保护层,所以可作为起杀菌作用的治疗药物。是由噬菌体的碎片组成的高分子质量颗粒, 它能消除目标菌，从而达到治疗的目的，可由许多来自肠杆菌科和其他革兰氏阴性细菌的噬菌体产生。2021/4/26

22、61噬菌体治疗较抗生素治疗的优势噬菌体呈指数增殖，自我复制能力大，每一个裂解周期均能产生大量子代噬菌体细菌很难对噬菌体产生耐药性噬菌体药效持续时间长准确选择相应的噬菌体也可作为预防用制剂噬菌体获取比较方便，价格比较低廉, 研制开发的周期短，成本低2021/4/2662噬菌体治疗的不足噬菌体的宿主范围有限2021/4/2663噬菌体治疗的不足免疫源性： 噬菌体作为动物体的异源物质，会刺激机体产生免疫反应，产生的抗体可能抑制噬菌体使其失去侵染敏感细菌的能力，限制其抗菌作用。2021/4/2664噬菌体治疗的不足噬菌体可释放一些毒素 编码大肠杆菌O157的毒力基因stx1和 stx2可以导致发炎反应

23、和提高致病性。2021/4/2665噬菌体治疗的发展趋势扩大噬菌体谱 改造宿主菌的裂解方式开发噬菌体抗感染药物发展趋势 大多数噬菌体都是专一性的对某种细菌起作用，治疗范围受限，我们可以通过基因工程技术将多种噬菌体吸附宿主菌的关键基因转化入同一噬菌体中并使之表达，从而产生一种可以对多种细菌同时具有裂解作用的新噬菌体。噬菌体通过holin蛋白和细胞内溶素两种物质造成细菌裂解。通过对产生这两种物质的基因进行改造，改造后的噬菌体具有高效杀死细菌的能力。目前美国4家公司正试图研制针对一些重要的病原菌,如耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和食物传播的病原菌(沙门菌)的噬菌体。

24、Phage Ther-apeutics公司抗葡萄球菌制品已配制完成,其制造工艺已获FDA批准。2021/4/2666有的噬菌体基因组较大，可将外来目的DNA替代或插入到噬菌体基因组的某些序列中，使目的DNA随噬菌体的繁殖而大量复制和表达。 第四章 噬菌体载体2021/4/2667噬菌体载体分类1 噬菌体 载体噬菌体载体P1噬菌体载体M13噬体 cos载体和噬菌粒2021/4/2668噬菌体颗粒中 的DNA是一线性 双链DNA分子，长 48 502bp，两端 各有12个碱基的 5凸出黏性末端 是互补的。进入 细胞的DNA通过 两端的黏性末端环化。 噬菌体22021/4/2669 噬菌体性质与用途

25、在DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆能承载比较大的外源DNA片段，约23kb左右用途:主要用于cDNA文库构建和外源目的基因的克隆。22021/4/2670噬菌体基因图谱32021/4/2671噬菌体载体的构建切去DNA上部分非必需的区域和多余的限制性核酸内切酶切割位点插入可供选择的标记基因21建立噬菌体体外包装系统 3基本策略42021/4/2672DNA载体的构建缩短长度 插入型载体插入位点体外包装载体长度 37 kb插入片段大小：0 - 14 kb（51 37）插入片段体外包装2021/4/2673噬菌体克隆载体的主要类型插入型载体2021/4/

26、2674DNA载体的构建载体长度 26 kb插入片段最小装载长度 10 kb（36 26）体外包装体外包装插入片段最大装载长度 25 kb（51 26）2021/4/2675噬菌体克隆载体的主要类型替换型载体2021/4/2676噬菌体标记基因 重组体：正常生长非重组体：不生长 重组体：白色的噬菌斑 非重组体:蓝色的噬菌斑 重组体：清晰型透明斑非重组体:浑浊型噬菌斑cI基因lac Z基因red gam基因 重组体：清晰型透明斑非重组体:浑浊型噬菌斑cI基因2021/4/2677噬菌体载体克隆DNA片段步骤2021/4/2678构建噬菌体基因组文库的步骤构建噬菌体基因组文库的步骤包括:获得含基因

27、的DNA片段与噬菌体克隆载体重组转化受体菌和筛选克隆子2021/4/26792021/4/2680噬菌体载体的应用实例1 吉林大学的韩俊友博士应用噬菌体载体TripIEx2构建了牛蛙皮肤cDNA文库,为进一步研究牛蛙皮肤组织抗菌肽奠定基础。2021/4/2681噬菌体载体的应用实例2 中山大学的李艳雯教授应用噬菌体载体TripIEx2构建了大肠癌细胞cDNA表达文库 该文库包含了大肠癌HRT18细胞株所有的肿瘤抗原cDNA，使得获得大肠癌肿瘤抗原基因更加容易。2021/4/2682噬菌体载体的应用实例3 刘运洪等人利用噬菌体载体pC0mb3XS通过噬菌体展示技术构建抗人VEGFRZ（血管内皮生

28、长因子受体）噬菌体抗体库。为抗肿瘤治疗研究奠定了基础。2021/4/2683Section 5 Transduction Application transduction is a common tool of bacterial genetics reseach. It can be used to transfer genes between bacteria, complementary tests,and gene mapping, in particular analysis gene structure through gene transduction 应用转导是细菌的遗传学研究

29、中的一种常用研究手段。它可以用来在细菌间转移基因，进行互补测验，进行基因定位，特别是通过共转导方法进行基因的精细结构分析。2021/4/2684Section 5 TransductionTransduction： In the process, The bacteriophage as a media, the bacterial gene is transducted into other bacteria.转导：以噬菌体为媒介，将细菌基因导入另一细菌的过程。2021/4/2685Generalized transductionBacteriophages infect bacterium

30、Bacteriophages replicate in the bacteriumhost DNA breakbacteriophage assemble protein shell which host DNA fragmentation is in itBacteriophage with host gene infects the recepient bacteriaum2021/4/2686Generalized transductionThe original host DNA fragments occur exchange reorganization with recepien

31、t bacteriumAssemble protein shell 2021/4/2687 3Generalized transductionThe use of generalized transduction It can transduct anypart of the bacterial genome2021/4/2688Bactriophage infect donor bactiumBactriophage repication BactriophageassembleBactriophageinfectHomologous recombination2021/4/2689Spec

32、ialized transductionSpecialized transduction Lysogenic prophage loses its dormant state and excised from the host DNA. Rarely the excision process is inaccurate, the phages carry and transfer host genes between bacteria 结合态噬菌体切离宿主DNA，携带部分宿主基因，再次侵染时与受体菌DNA同源互补及交换重组 。 2021/4/2690Specialized transducti

33、on2021/4/2691Specialized transduction2021/4/2692 In genetic engineering ,we can put the cloned gene into the phage DNA by recombinant DNA technology ,and then wrap it in the phage coat protein ,go to infected host cells in order to prepare genomic library. 在遗传工程中可以把所要克隆的基因通过重组DNA技术插入到噬菌体的DNA中，然后通过离体

34、包装方法把它用噬菌体外壳蛋白包装起来，再去感染寄主细胞以制备基因文库。2021/4/2693The example of transductionVictor Ravin complished the effective plasmid pX3 transduction in Lactobacillus delbrueckii (德氏乳杆菌)by bacteriophage LL-H2021/4/2694The method Preparation of plasmid transformants of L. delbrueckii LKTPurication of phages and th

35、eir DNAsThe restriction endonuclease digestions and agarose gel electrophoresis of DNA samples, blottings, and hybridizations were carried outTransduction2021/4/2695ResultsThe bacterial cells of ATCC 15808 were infected with purified phages propagated in the plasmid transformant strains LKT(pX3) or LKT(pJK650)Negative controls convinced that no viable LKT(pX3) transformant cells were present in LL-H(pX3) or LL-H(pJK650) phage preparations used for transduction.2021/4/2696Phage LL-H transduced plasmid pX3 from strain LKT(pX3) to each of all five tested L. delbrueckii stra