HIV1 Tat 蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究

1、李在留刘朝奇，邹坤，李凤兰，韩钰，杨凡，王磊黎【摘要】目的创立HIV-1Tat卵白结合Tar的抗HIV-1药物挑选模子用于抗HIV药物筛眩要领构建表达HIV-1Tat卵白的真核表达质粒pDNA3.1(+)-Tat和HIV-1LTR-lu荧光素酶陈诉基因，接纳脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat卵白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达环境，创立HIV-1Tat卵白结合Tar的细胞模子，用于抗HIV-1的药物筛眩以DRB5,6-二氯-1-呋核亚硝脲-苯并咪唑为阳性比较，举行模子的创立及条件的优化。结果通过重复试验表白，目的基因和陈诉基因的配比、转染时造就液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染

2、前细胞状态以及药物作用时间的是非等对模子的不变性和敏感性有影响。结论应用优化的细胞模子对文冠果、紫苏等浸提物举行挑选及结果的阐发。【关键词】HIV-1TatLTR-Lu荧光素酶基因艾滋药物挑选模子Keyrds:HIV-1Tat;LTR-Luluiferasegene;delfrsreening人类免疫缺陷病毒HIV是得到性免疫缺陷综合征AIDS的病原体；是一种逆转录RNA病毒，被称为“20世纪的瘟疫，在环球广为流传，至今尚无根治药物。现已容许上市的药物HIV卵白酶、逆转录酶按捺剂只能缓解病痛，代价昂贵、毒副作用大，病毒易产生变异性、耐药性，药效较差、抵消等1，2。因此，从艾滋病病毒的底子研究中

3、探求新的不易产生耐药性的靶点成为国表里研究热门。如今抗HIV药物的研究重点会合在逆转录酶、卵白酶、整合酶及病毒吸附、交融等几个靶点。HIV反式激活因子(transativatr，Tat)作为HIV的调治卵白，不但可以通过反式激活效应调控病毒基因的复制与表达，还可以诱导细胞凋亡，激活静态T淋巴细胞，按捺免疫细胞的分化和增殖，有助于病毒的熏染和体内流传，导致种种并发症等3，4。Tat与反式激活效应区trans-ativatrrespnseregin，TARRNA彼此作用，反式激活转录。Tat和TAR的布局具有高度守旧性，使它成为探求新的作用机制和不易产生耐药性的抗艾滋病药物的非常有吸引力的新靶点5

4、。Tat基因编码卵白可与HIV-1病毒长末了重复序列LTR结合，以增长病毒全部基因转录率，也能在转录后促进病毒RNA的翻译，导致病毒的复制增长6。本研究通过创立HIV-1Tat和LTR的结合，导致陈诉基因荧光素酶在细胞内的高表达，反响Tat和LTR序列的有用结合，创立Tat的反式激活效应调控病毒基因的复制与表达模子，从而用于自然药物有用身分的挑选，具有简朴、快速、微量、用度低廉、宁静、不受P3实行室限定，不消同位素等特点，可为实行室创立抗HIV-1药物挑选模子提供鉴戒与引导，具有较强的理论意义。1质料与要领1.1质料HIV-1Tat卵白的真核表达质粒pDNA3.1(+)-Tat及陈诉基因HIV

5、-1LTR-lu(LTR-LU)由三峡大学分子生物学研究所构建保存。HeLa细胞株由北京协和医科大学惠赠。Lipfetaine2000、pti-E造就液均为Invitrgen公司试剂，新生牛血清NS为GIB公司产物。DE造就基、胰卵白酶、底物Luiferin、阳性比较DRB，细胞裂解液1,2-diainyllhexane-N,N,N,N-tetraaetiaid，考马斯亮兰等药品均为Siga公司产物。1.2要领构建表达HIV-1Tat卵白的真核表达质粒pDNA3.1(+)-Tat、HIV-1LTR-lu荧光素酶陈诉基因，接纳脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat卵白在HeLa细胞内的

6、表达环境，创立HIV-1Tat卵白结合Tar的抗HIV-1的药物挑选模子。转染后的细胞参加对细胞毒性在20%以下的药物浓度，以DRB为阳性比较Tat/Tar按捺剂，anebetal.,1997;Nekhaietal，1997，造就一按时间后网络细胞裂解液上清检测相对荧光值RLU，考马斯亮兰G-250测定卵白含量，在卵白含量同一的条件下，药物对Tat卵白表达的按捺作用表现为药物组与空缺比较组RLU的差值。2结果与阐发从表1和图1可看出：RLU值随着两种质粒总量的增长而明显增长，当两种质粒都为0比较时，RLU值极低，即：未转染；当两种质粒的含量达20l时，RLU值可达3108，且随着LTR-Lu含

7、量的低落而显着低落，但不由其决定，由于当LTR-Lu含量均为10l，而pDNA3.1(+)-Tat的含量由10l变为0时，其RLU值低落了100倍，充实说明LTR-Lu的表达必要pDNA3.1(+)-Tat刺激。当pDNA3.1(+)-Tat为3l，LTR-Lu为1ul时，RLU值为5459851可作为较佳的配比，开端创立模子。表1pDNA3.1(+)-Tat与LTR-Lu差异含量、差异配比转染HeLa细胞所得结果略2.2模子的不变优化实行结果表2所得结果再次验证了表1中结果。此中a1b2，a2b2组合所得RLU值相对别的组合值较适中，对其举行药物挑选实行，同样参加对细胞毒性低于20%的药物浓

8、度，颠末重复实行，a2b2组合中药物作用结果明显，a1b1组合中不显着，表白转染率凹凸影响药物作用结果，进一步确定a2b2组合为优化质粒配比，即：pDNA3.1(+)-Tat与LTR-Lu别离以0.017，0.0017g/l配比转染Hela细胞可以得到较高的Tat卵白表达，且待测药物对其按捺作用敏捷，尤其阳性比较DRB表现出较为明显的按捺率。表2pDNA3.1(+)-Tat与LTR-Lu梯度稀释配比转染HeLa细胞所得RLU值略表中a表现质粒pDNA3.1(+)-Tat，此中a1为原液；a2为3倍稀释液；a3为9倍稀释液；a4为27倍稀释液；a5为0；b表现LTR-lu，此中b1为原液，b2为

9、10倍稀释液，b3为30倍稀释液从表3及图3可看出，随着转染历程中NS含量的升高，细胞转染率明显低落，当NS含量为5%时，药物按捺率较为显着，故确定NS用量为5%。表4和图4所得结果表现：随着24孔板中细胞密度的减小，RLU值减小，药物按捺作用无显着变革。此中4倍、8倍稀释液RLU值较低，结果可信度小；不稀释或2倍稀释下RLU值较高，药物作用同等。故转染细胞可均匀分传入两块24孔板，举行大批量药物筛眩表4转染细胞分传密度对药物按捺作用的影响略表5及图5表白：随着DRB浓度的低落，RLU值低落，即：DRB对Tat卵白的按捺作用低落，DRB的按捺作用与其剂量呈依靠性干系；进一步说明本模子构建乐成，

10、不变性好、重现性强。别的，DRB对细胞毒性较大，在大于50l/l时，细胞部门殒命，随着其浓度的增长，细胞殒命数目增多。3讨论艾滋病药物挑选暂无抱负的动物模子，如今重要从细胞和分子程度上举行体外挑选8。王岱等7初次应用牛免疫缺陷病毒(BIV)合胞体和BlV长末了重复序列(LTR)引导的荧光素酶(Lu)基因，创立抗AIDS药物的挑选和评价模子。随着基因工程、生物化学和分子生物学及检测仪器的生长，该模子原理、机理方面得以深化研究，由HIV代替BIV912，但对其创立要领等仅作扼要先容。本研究初次对该模子的实行室构建、模子优化等举行了全面、体系的研究，进一步美满了该模子，为抗HIV药物挑选积聚资料。表5药物浓度的影响实行略颠末优化创立的细胞模子，其结果表白：目的基因与陈诉基因的配比起决定性作用，当两者含量过高时，Tat表达量大，药物险些无按捺作用，以0.017，0.0017g/l配比可以得到较高的Tat卵白表达及明显的药物按捺作用；