基因的重组与转移ppt课件

1、外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达衔接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第六章 基因的重组与转移 第一节 重组DNA分子的构建一、基因重组概念利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，将两者衔接起来，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到正确表达。二、基因重组的思索要素实验步骤简单易行，衔接效率较高，易于重组子挑选2. 可以回收插入的外源基因3. 外源基因必需在表达载体DNA的控制下，并置于正确的阅读框架内，以便目的基因的正确表达三、表达载体DNA理想的酶切位点应该符合下面几个条件1. 载体上特定的酶切位点尽能够少最好是单一酶切位

2、点2. 酶切位点之前要有一个较强的启动子高效表达一粘性末端的衔接DNA衔接酶把相互接近的5端磷酸与3-OH连到一同四、 载体DNA与外源基因片段的衔接1. 两段DNA的衔接依托粘性末端2. DNA片段与载体的衔接依托粘性末端ligasenick(二)平齐末端blunt end的衔接5端与3端并列接近的时间太短，不容易被衔接酶衔接。1. 直接衔接T4DNA衔接酶虽然能衔接平末端，但效率很低，只需粘性末端的1%。55553333-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-53-OH-PP-HO-531同聚加尾法 2. 人工加尾构成 “粘性末端DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上

3、脱氧核苷酸。原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。加尾碱基互补缺陷：优点：能把任何片段衔接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点用T4 DNA衔接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，构成一个人工粘性末端。2衔接子(linker)衔接 linker用化学合成法合成的一段8-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用 缺陷：1可以用内切酶把插入片段切下来。假设插入片段内部也有该酶位点，不能切下完好的插入片段2能给载体衔接上Polylinker:优点：3DNA接头 (adapter)衔接法1978年康内尔大学的

4、吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5BamHI adapter用T4DNA衔接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 adapter一头平末端、另一头粘性末端某种酶切位点序列。 adapter的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P55p-GATCCCGG- GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5接头自我衔接接头与接头会彼此以粘性末端接在一同，影响与DNA片

5、段的衔接。优点：连上后就能用。缺陷：先用小牛肠碱性磷酸酶CIP处置接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我衔接。以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。防止自我衔接5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5接头之间不能构成磷酸二酯键自我衔接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OHHO-GGCCCTAG5CIP处置-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P 5GATCCCGG- HO-

6、GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG55GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5缺口缺口HO-OHCIP处置T4 ligase虽然有缺口，但依然能与DNA片断衔接。(三)PCR产物的衔接1. 在引物的5端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；1设计原那么2带酶切位点的引物的构造3端1520bp与模板互补；5端610bp是某个内切酶的识别序列。5端多余的35bp属维护碱基防止与所扩增的DNA片断内部酶切位点反复。引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5-3GCAGAATTC互补序列5-33模板GCAGAATTC互补序列 PCR产物5-33复性延伸模板模板33GCTAGCCGG互补

7、序列模板BamH I 位点-53-5复性延伸模板模板33GCTAGCCGG互补序列-53-模板5GCTAGCCGGPCR产物 互补序列-53-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5-3GCTAGCCGGPCR产物-53-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5-3GCTAGPCR产物-53-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！2. 与T载体直接衔接1PCR产物两个3端普通都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸优先加A。2T载体的两个3端人为地各加一个T利用Taq DNA聚合酶，当

8、原料中只需dTTP时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶载体PCR产物TATA(四)DNA体外衔接应留意的事项插入片断与载体的酶切位点互补一样的粘性末端才干有效地衔接。尽量防止平端衔接。决不能进展非粘性末端衔接。EcoRIEcoRIEcoRI1用一样的酶切2用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。2. DNA插入的方向正确1用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向衔接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3. 插入基因的开放阅读框ORF正确1DNA定向插入2起始密码尤其

9、当载体上有ATG起始密码的时候，更要留意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组但移码突变！4. 防止载体本身环化衔接1提高插入片断的用量衔接反响体系中，插入片断比载体多10倍以上。2用碱性磷酸酶处置载体载体切口的5磷酸被除去，不能自我衔接。但可以与插入片断以单链衔接。53载体插入片断4运用同尾酶产生的粘性末端衔接方法酶切反响后不用将核酸内切酶失活再进展衔接反响3采用同聚物加尾衔接技术线状DNA分子的两个3-OH末端具有同样的碱基构造1. 载体本身环化衔接能存活2. 载体之间相互衔接能存活3. 插入片段相互衔接不能存活4. 一个载体

10、与几个插入片段重组能存活(五)载体和外源DNA插入片段的衔接结果5. 几个载体与一个插入片段重组能存活171. 目的添加受体菌细胞膜的通透性。第二节 重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备什么是感受态？就是细菌吸收转化因子的生理形状。运用丧失了限制体系的大肠杆菌；具有与重组体互补的遗传性状；重组整合缺陷型。2. 菌种用低渗CaCl2溶液在低温时处置快速生长的细菌，此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易构成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌外表，促进细胞对DNA的吸收。 3. 制备原理4. 制备过程培育大肠杆菌OD600至0.3-0.4On ice 30 min4离心搜集菌用冰

11、冷的0.01MCaCl2重悬4离心搜集菌分装、-70 冻存On ice 20 min用冰冷的0.01MCaCl2重悬二、重组DNA导入大肠杆菌1转化transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。2转染transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1. 外源DNA导入细菌的几种方法3转导transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。2. 转化率每gDNA转化胜利的细菌克隆数。3. DNA分子的转化过程 吸附:完好的双链DNA吸附在受体菌外表 转入:双链DNA分子解链 单链DNA进入受体菌,另一链降解 自稳:单链DNA在细胞内复制成双链环状 表达:外源基

12、因同复制子同时复制、转录、翻译4. 转化方法 简单，但转化效率不高106-108/gDNA。1热休克法heat shock转化效率高高于109/gDNA。2电转化法50ng载体DNA100L感受态菌On ice混合，静置30分钟42C 90秒参与800 L LB培育基37摇45min10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA1热休克法LB培育受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2 离心集菌冰冷的水重悬菌体2 离心集菌冰冷的水重悬菌体2 离心搜集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNAOn ice混合

13、参与1mLSOC培育液37 中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化2电转化法5. 平板培育基培育细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37过夜环形重组质粒质粒自我衔接线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。环形质粒数1重组质粒 6. 影响转化率的要素生长形状制备感受态菌必需运用对数生长期的菌。必需在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在-70以下CaCl2处置运用感受态菌时必需迅速融化融化后普通不能再次冻存运用。2感受态细胞 competent cells) 把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染才干的噬菌体颗粒。7. 体外

14、包装的噬菌体的转导1体外包装in vitro packaging 2转导transduction经过受体菌细胞外表的DNA接受器位点receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进展扩增。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培育细菌时可以坚持溶源性。但当温度升高到4445时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。3cI857基因突变的噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857其它基因溶源形状DNA不转录、不翻译DNA阻遏蛋白阻遏蛋白4445DNA转录、翻译合成外壳蛋白32噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白尾部蛋白。在cI857基因突变的噬菌体的根底上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。4 互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白头部、尾部蛋白。噬菌体2(5) 体外包装过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，构成噬