第三章基因重组ppt课件

1、欢 迎第三章 可挪动的遗传因子和染色体外的遗传因子第一节 转座子第二节 质粒第三节 遗传重组根本要求1.掌握转座子的定义 2.了解转座子机制 3.掌握质粒相关特性4.掌握同源重组的模型，位点特异性重组 5.重点掌握相关定义 第一节 转座子一.转座子的发现二.转座子的定义与构造特征三.转座子机制四.转座效应五.逆转录转座子DNA transposable element一.转座子的发现1951年，在冷泉港生物学专题讨论会上，麦克林托克递交了本人的学术论文，向科学界同行报告了她的新实际。她提出遗传基因可以转移，能从染色体的一个位置跳到另一个位置，甚至从一条染色体跳到另一条染色体上。她把这种能自发转

2、移的遗传基因称为“转座因子 。 “转座因子除了具有跳动的特性之外，还具有控制其他其因开闭的作用，因此“转座因子又可叫做“控制因子。转座实际不被接受在当时，占统治位置的染色体遗传学实际以为，生物细胞内的遗传物质比较稳定，遗传基因以一定的顺序在染色体上作线性陈列，彼此之间的间隔也非常稳定。常规的交换和重组只发生在等位基因之间，并不扰乱这种间隔。除了在显微镜下可见的、发生频率极为稀少的染色体倒位和相互易位等畸变可以改动基因的位置外，人们还从未认识到，也难以想象出基因会从一处腾跃到另一处。终被接受整个70年代，分子遗传学家找到了愈来愈多的可挪动的或可转移的遗传因子， 又称之为“腾跃基因 。这些因子不仅

3、存在于细菌中，同时也存在于较高等的动物中。麦氏的实际又得到了进一步的验证。 麦克林托克30年代初做出的发现、40年代提出的实际，到60年代末终于被重新提起，80年代初为科学界普遍接受。她走在时代前面四十年，同时也为此冷落斗争了四十年。 二.转座子的定义与构造特征DNA的转座，或称移位transposition，是由可移位因子transposable element介导的遗传物质重排景象。曾经发现转座这一命名并不非常准确，由于在转座过程中，可移位因子的一个拷贝经常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制。转座子的定义在原核生物和真核生物基因组中,

4、存在着可以从一个部位转移到另一个部位的一些DNA序列,这些DNA序列就称为转座子(transposon)。转座子的分类和构造特征简单转座子insertion sequence，IS 常被称为插入序列。它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子经常被定位到特定的基因中，呵斥该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，中间带有介导本身挪动的转座酶,两端带有反向反复序列.原核生物的转座子-插入序列IS转座子的分类和构造特征复合式转座子composite transposon是一类带有某些抗药性基因的转座子，其两翼往往是两个一样或高度同源的IS序列，阐明I

5、S序列插入到某个功能基因两端时就能够产生复合转座子。IS ISResistance Gene(s)复合转座子Tn转座子A家族(TnA)是一类除了和它的转座作用有关的基因外,还带有其它基因的转座子. TnA长约5kb,两端具有ITR(38bp),而不是IS,中部的编码区不仅编码抗性标志,还编码转座酶和解离酶.靶点(5bp)的选择有区域倾向性,但在优先区域内选择是随机的.转座噬菌体是一种以溶菌和溶源周期性交替方式生长的噬菌体,它不象 噬菌体那样有一定的整合位点.Mu噬菌体的整合特征将在基因表达与调控一章讲解.三. 转座子机制转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的3-12

6、bp、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个反复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同。三种不同类型的转座1复制型转座replicative transposition作为本身挪动的一个部分，转座子被复制，一个拷贝依然保管在原来的位置上，而另一个那么插入到一个新的部位，这样转座过程伴随着转座子拷贝数的添加。2 非复制型转座转座元件作为一个物理实体直接由一个部位转移到另一个部位。 IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进展转座。3保守型转座保守型转座是另一种非复制型的转座过程，该过程中转座元件从供体部位被切除并经过一系列的过程插入到靶部位，在该过程中每个核苷键皆被保管。该转座过程与

7、的整合机制类似，并且转座酶与整合酶家族有关。转座的机制：复制型转座需求交融构成共合体A. 切开： 转座酶识别受体的靶序列，在两条单链上均切开，构成粘性末端；识别本身的反向反复序列，在3端切开。B. 衔接：供体和受体结合构成不完好共联体，留下缺口。C. 复制：DNA聚合酶补齐缺口，再衔接构成完好的共联体，具有反复序列。D. 重组：在特定位点进展重组，共联体分别：留下原来的转座子；并在靶序列上插入转座子，两端有同向反复序列。非复制型转座断裂和重接反响 使靶重构。供体坚持裂缺。不构成共合体。 Tn10转座需求的酶及转座频率的控制四. 转座效应 转座引起插入突变 转座产生新的基因 转座产生的染色体畸变

8、 转座引起的生物进化.五.逆转录转座子关于逆转录病毒复制的内容将在复制一章讲解。逆转录病毒的转座请看视频。第二节 质粒一.质粒的定义二.质粒的类型三.质粒的特性四.特殊细菌质粒 一.质粒的定义1.1 定义和命名质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子，不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的，符合这三条规范的染色体外DNA或RNA分子都可以称为质粒。狭义的质粒普通是指细菌染色体外的环状DNA分子。质粒的命名：一个小写字母 p 加 2-3 个大写字母和数字，如 pJP4，pDTG1。 1.2 细菌质粒细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状DNA分子 (cccDNA)。根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成

9、抗性质粒、降解质粒、毒力质粒和共生质粒等类型。 1.3 真核生物的DNA质粒 环状DNA质粒：酵母2mm质粒，植物线立体中的环状DNA质粒，人和动物的核DNA质粒等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。 线状DNA质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNA质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状DNA质粒。1.4 真核生物的RNA质粒有壳体的dsRNA质粒：由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和植物细胞中，由于它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒和植物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNA质粒。与RNA病毒的主要区别是它们不具有感染性无壳体的dsRNA质粒：存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒ds

10、RNA质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNA质粒。 二. 质粒的分类：根据质粒能否经过细菌的接协作用进展传送 1接合性质粒 2非接合性质粒根据质粒在细菌内拷贝数多少 1严紧型质粒 2松弛型质粒根据相容性 1相容性几种质粒同时共存于同一菌体内 2不相容性不能同时共存 可借此对质粒进展分组、分群特殊细菌质粒1F质粒致育因子 Tra区：编码转移相关蛋白；合成性纤毛 2R质粒抗药因子 -RTF基因抗性转移因子 -抗性决议子 抗抗生素、抗药、抗种金属3Col质粒大肠杆菌素因子 -产大肠杆菌素 细菌素：由细菌质粒编码产生的只能 抑制或杀灭近缘细菌或同种 不同菌株的蛋白质。4致病性质粒： -肠毒素、内

11、毒素E.Coli -溶血素、肠毒素S.aureus5共生固氮质粒： -结瘤基因nod -固氮基因nif6隐蔽质粒：未有明确表型 具有自我复制的才干拷贝数低者，复制往往与染色体的复制同步，称为严密型质粒。拷贝数高者，与染色体的复制不相关，称松弛型质粒。 编码的基因产物能赋予细菌某些特性非细菌生命活动不可短少的三. 质粒DNA的特征 质粒可自行丧失与消除 质粒的转移性 质粒的相容性与不相容性两种构造类似亲密相关的质粒不能稳定共存于一个宿主菌的景象称为质粒的不相容性。几种不同的质粒同时共存于一个菌细胞内那么称相容性。第三节 遗传重组一.同源重组二.位点特异性重组三.等位基因间重组遗传重组引言DNA分

12、子内 或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组 (genetic recombination),或者基因重排(gene rearrangement) 。重组产物为重组体DNA (recombinant DNA) 。DNA的重组广泛存在于各类生物。真核生物基因间重组多发生在减数分裂(meiosis)时同源染色体之间的交换(crossover) 。细菌及噬菌体的基因组为单倍体，来自不同亲代两组DNA之间可经过多种方式进展遗传重组。遗传重组总结遗传重组：呵斥基因型变化的基因交流过程。发生：减数分裂性细胞内，体细胞地点： 核基因间，叶绿体基因间，线粒体基因间；前提条件：不同基因型的遗传物质彼此可以

13、转移。作用： 保证了遗传多样性,为选择奠定了物质根底,使生物得以进化开展，与突变一同是变异的来源DNA重组对生物进化起着关键的作用。生物进化是生物随时间发生变化和多样化的过程。生物进化以不断产生可遗传的变异为根底。首先有突变和重组，由此产生遗传的变异，然后才有遗传漂变(genetic drift)和自然选择(natural selection)，才有进化。可遗传变异的根本缘由是突变。然而，突变的机率很低，而且多数突变是有害的。假设生物只需突变没有重组，在积累具有选择优势的突变同时不可防止积累许多难以摆脱的不利突变，有利突变将随不利突变一同被淘汰，新的优良基因就不能够出现。重组的意义在于，它能迅

14、速添加群体的遗传多样性(diversity)；使有利突变与不利突变分开(separation)；经过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。遗传重组的生物学意义遗传重组主要类型：(根据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求) 同源重组 位点专注性重组 转座重组 异常重组 其共同点是双股DNA间的物质交换，但发生的情况不同。发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称根本重组。是最根本的DNA重组方式，经过链的断裂和再衔接，在两个DNA分子同源序列间进展单链或双链片段的交换。真核生物非姊妹染色单体的交换，姊妹染色单体的交换，细菌及某些

15、低等真核生物的转化，细菌的转导、接合等都属于这类型。一、同源重组同源重组的Holliday模型Robin Holliday于1964年提出了重组的杂和DNA模型，又称Holliday模型。该模型对重组过程的解释如下：A、同源的非姐妹染色单体联会；B：同源非姐妹染色单体DNA中两个方向一样的单链，在DNA内切酶的作用下，在一样位置同时切开；C：切开的单链交换重接;D：构成交联桥构造；E：交联桥沿配对DNA分子“挪动。两个亲本DNA分子间呵斥一大段异源双链DNA Holliday构造F：绕交联桥旋转1800；G：构成Holliday异构体；H、经过两种方式之一切断DNA单链，假设左右切，那么构成非

16、重组体，假设上下切那么构成重组体。HOLLIDAY模型Holliday模型可以较好解释同源重组景象，但也存在问题。该模型以为进展重组的两个DNA分子在开场时需求在对应链一样位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难想象两个分子何以能在同一位置发生断裂。Meselson M和Radding C对此提出了修正意见，他们以为同源DNA分子中只需一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一DNA分子的同源区，呵斥链的置换，被置换的链再切断并与最初断链衔接，即构成Holliday中间体。Meselson-Radding模型 Holliday模型中为对称的杂合双链，而实践情况有不均等分别景象，19

17、75年Meselson-Radding 提出模型解释这种不对称重组景象： 1.单链切断 2.链置换 3.单链入侵 4.泡切除 5.链同化碎链吸收 6.异构化Holliday 7.分支迁移 内切酶 (RecBCD)DNA侵扰(RecA)分支迁移 (RuvAB) 内切酶(recBCD) DNA 衔接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体53535353目 录Holiday中间体535353535355533355553333555533335555333355553333内切酶(ruvC)内切酶(ruvC) DNA衔接酶 DNA衔

18、接酶交互重组拼接重组目 录旋转双链断裂重组模型更多的现实阐明，重组是由双链断裂所启动。DNA分子双链断裂才干与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去。双链断裂启动重组细菌的基因转移与重组 细菌可以经过多种途径进展细胞间基因转移，细菌的基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)和细胞交融(cell fusion)。1细菌的接协作用细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞，称为接协作用。供体细胞被定义为雄性，受体细胞为雌性。经过接合而转移DNA的才干是由接合质粒(conjugat

19、ive plasmid)提供的，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。F质粒的接合F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipientF+2细菌的遗传转化遗传转化(genetic transformation)是指细菌品系由于吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状的改动景象。具有摄取周围环境中游离DNA分子才干的细菌细胞称为感受态细胞(competent cell)。很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的才干(如固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏球菌及嗜血杆菌等) 。目 录3细菌的转导转导(transduction)是经过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。转导有两种类型

20、：普遍性转导(generalized transduction),是指宿主基因组恣意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌；局限性转导(specialized transduction)，某些温暖噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA。在上述两种类型中，转导噬菌体均为缺陷型，由于都有噬菌体基因被宿主基因所取代。缺陷型噬菌体依然将颗粒内DNA导入受体菌，前宿主的基因进入受体菌后即可与染色体DNA发生重组。 转导 接合 转化同源重组的酶学同源重组需求许多蛋白因子参与,其中编码这些蛋白质的基因有27种,起最主要作用的,并且了解较清楚的的有蛋白质R

21、ecBCD,RecA,RuvAB和RuvC.RecBCD酶是一种多功能酶,该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。Rec BCD酶具有三种酶活性： 依赖于ATP的核酸酶活性， ATP依赖的解螺旋酶活性， ATPase活性。当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供应。及至酶挪动到chi位点(5GCTGGTGG3)，在其3侧46个核苷酸处将链切开，产生具有3末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组的chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，成为重组热点。RecA蛋白在大肠杆菌中，RecA蛋白参与重组是最关键的步

22、骤。RecA有两个主要的功能：诱发SOS反响和促进DNA单链的同化(assimilation)。所谓单链同化即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的构成，分支挪动等步骤得以产生。当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上，构成螺旋状纤丝(helical filament)。RecF、RecO和RecR蛋白调理RecA纤丝的装配和装配。图4-3RecA蛋白介导的DNA链交换模型 A:DNA链交换的侧面观: 1.RecA蛋白与单链DNA结合；2.复合物与同源双链DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来;B:

23、DNA链交换过程RecA蛋白的横切面 RuvA可识别Holliday衔接的构造；RuvB是一种ATPase，它可发动迁移反响。右图表示复合体的功能。RuvA结合在交换点上的一切4条链上。RuvB是六聚体，它围绕在交换点上游的每一条DNA双链的周围。ruvC编码一个可特异识别Hollidy分枝构造的内切酶，该酶可切开Holliday 衔接体，解离重组中间体。Rec BCD途径Rec BCD蛋白在chi位点3侧的一条链上产生切口。Rec BCD蛋白同时具有解螺旋酶的活性，使chi位点附件切口的DNA解链单链区被Rec A蛋白和SSB蛋白覆盖RecA 蛋白使单链DNA取代双链DNA中的同源部分 Dl

24、oop区域的DNA产生切口，新切口的3端 the tail of newly nicked DNA 与另一条DNA的单链区互补配对DNA衔接酶封锁切口，构成Holliday junctionRuvA 和RuvB发动迁移反响RuvC拆分重组中间体二、 特异位点重组 特异位点重组广泛存在于各类细胞中，起着非常特殊的作用，彼此有很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调理，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在一个特定的短的(20200 bp)DNA序列内(重组位点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助因子对其识别和作用。 位点专注性重组/保守性重组 原核生物中最为典型 特点： 供体与受体的特定位点的短同源序列之间。 DNA准确切割 衔接 噬菌体DNA经过其attP位点和大肠杆菌DNA的attB位点之间专注性重组而实现整合过程。条件：一段15bp的同源序列和位点专注性的蛋白质因子不能催化其他任何两条不论是同源的还是非同源序列间的重组，从而保证了噬菌体整合方式的专注性和高度保守性，因此又称保守性重组。而且这一重组不需求RecA 蛋白质的参与.1.噬菌体对E.coli的整合噬菌体的整合与切除 噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择，其