保元排毒丸微生物限度检查法的验证研究

1、保元排毒丸微生物限度检查法的验证研究【摘要】目确实认所采用的方法合适于供试品的微生物限度检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不计。方法采用2022版?中国药典?规定的验证方法。结果计数结果准确，符合要求。结论该实验合适保元排毒丸微生物限度检查方法的验证。【关键词】保元排毒丸微生物限度检查方法验证从理论上来讲，每个样品对微生物都会有影响，影响的程度有多大，检验方法能否保证污染的微生物可以检验出来，要通过试验来验证，才能保证微生物限度检查结果的准确性，而药品质量监视抽验合格率存在不尽明晰、全面、真实的突出问题1。按照?中国药典?2022版前规定的微生

2、物限度检验方法，有很多菌检不出，这就很难保证药品微生物限度检验结果的准确可靠，也给临床使用带来隐患。保元排毒丸系我院著名老中医张志坚主任医师长期临床理论经历方。临床用于慢性肾炎，慢性肾功能衰竭，见有头昏乏力，神疲肢软，尿少足肿，腰膝酸痛，纳呆泛呕，夜不能寐，面色晦暗，舌淡嫩，苔薄黄腻等病症，临床使用较广，因此必须保证保元排毒丸微生物限度检验结果的准确可靠。1器材1.2培养基营养琼脂培养基，青岛高科园海博生物技术20220309；玫瑰红钠琼脂培养基，宜兴市永信生物050915；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，宜兴市永信生物051027；胆盐乳酸培养基，宜兴市永信生物050509；营养肉汤培养

3、基，宜兴市永信生物051206；甘露醇高盐琼脂，青岛高科园海博生物技术20220112；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，宜兴市永信生物050921；改进马丁培养基，宜兴市永信生物050829。1.3验证用菌株大肠埃希菌Esherihiali(B)44102，第4代；金黄色葡萄球菌Staphylusaureus(B)26003，第4代；枯草芽孢杆菌(Baillussubtilis)(B)63501，第4代；铜绿假单胞菌(Pseudnasaeruginsa)(B)10104，第3代；白色念珠菌(andidaalbians)(F)98001第4代；黑曲霉Aspergillusniger(F)98003

4、第3代。1.4供试品及试剂保元排毒丸060810，江苏省常州市中医医院制剂；氯化钠溶液，分析纯。2方法2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证22.1.1供试液制备取供试品保元排毒丸10g，加pH无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100l，于45水浴中保温，浸泡，振荡溶解，制成110的供试液。2.1.2菌液制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新颖培养物分别接种至营养肉汤培养基中，3035培养2448h，分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含50100个fu菌落数的菌液。将白色念珠菌的新颖培养物分别接种至改进马丁培养基中，置2328培养箱中培养2448h，取上述培养物用0.9%无

5、菌氯化钠溶液制成每毫升含50100个fu的菌液。将黑曲霉的新颖培养物分别接种至改进马丁琼脂斜面培养基上，2328培养7d，使大量孢子产生。再参加5l0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒轻轻将孢子洗脱，然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10l吸管吸出孢子液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液将菌液稀释至每毫升含50100个fu的菌液。2.1.3验证方法平皿法常规法。实验组:取10个平皿，2个一组分成5组，分别做好大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的标记。各取110供试品保元排毒丸1l,分别参加10个平皿中，再依次参加上述5种菌的菌悬液1l(50100个fu),每株

6、菌平行制备2个平皿，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置3035培养48h和2328培养72h，测定试验组的菌数。菌液组：分别取上述稀释的菌液1l，注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置3035培养48h和2328培养72h，测定所加的试验菌数。供试品对照组：各取110供试液保元排毒丸1l分别注入4个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置3035培养48h和2328培养72h，以测定供试品的本底数。稀释剂对照组：本品未采用特殊方式处理和制备，故未做。上述方法平行实验3次。菌回收率计算：实验组的菌回收率%=实验组的

7、平均菌落数供试品对照组的平均菌落数/菌液组平均菌落数100%实验结果：见表1。2.2控制菌检查方法的验证22.2.1大肠埃希菌检查方法的验证实验组：取110的供试液10l，接种至100l的胆盐乳糖增菌培养基内，参加47fu/l大肠埃希菌1l，3537培养1824h，取上述培养液0.2l接种至5lUG培养基的试管内，培养5，24h，在345n紫外线下观察，均见荧光反响，滴加靛基质试液，液面呈玫瑰红色。阴性菌对照组：取110的供试液10l，接种至100l的胆盐乳糖增菌培养基内，参加66fu/l金黄色葡萄球菌1l，3537培养1824h，取上述培养液0.2l接种至5lUG培养基的试管内，培养5，24

8、h，在365n紫外线下观察，均无荧光反响，滴加靛基质试液，液面呈试剂本色。2.2.2大肠菌群检查方法的验证实验组：取110的供试液1l，接种10l胆盐乳糖发酵培养基管内，参加47fu/l的大肠埃希菌1l，置3537培养1824h。培养基出现混浊，产酸产气。表1保元排毒丸细菌、霉菌和酵母菌回收率的测定平皿法略阴性菌对照组：取110的供试液1l，接种10l胆盐乳糖发酵培养基管内，参加66fu/l的金黄色葡萄球菌1l，置3537培养1824h。未见产酸产气。2.2.3沙门菌检查方法的验证实验组：取10g的供试液直接接种至200l的营养肉汤培养基中，参加含66fu/l金黄色葡萄球菌1l，置3537培养

9、1824h，取上述培养液1l，接种至10l四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养1824h，划线接种于沙门、志贺菌属琼脂培养基的平板上，培养1824h，平板上生长出无色，半透明，菌落中心为暗色的菌落。阴性菌对照组：取10g供试品直接接种至200l的营养肉汤培养基中，混匀，参加含66fu/l金黄色葡萄球菌1l，置3537培养1824h，取上述培养液1l，接种至10l四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养1824h，划线接种于沙门、志贺菌属琼脂培养基的平板上，培养1824h，平板上无菌落生长。3讨论由表1可见保元排毒丸用平皿菌落计数法，3次平行实验中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落回收率都到达了70%以上，说明该方法用于细菌、霉菌及酵母菌计数结果是准确的。控制菌检查方法的验证实验说明：实验组检出了大肠埃希菌，乙型副伤寒沙门菌；阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌；乙型副伤寒沙门菌。说明保元排毒丸对大肠埃希菌无抑制作用，对大肠菌群无抑制作用，对沙门菌无抑制作用。本品稀释剂对照组未作特殊方式处理和制备，对细菌无损伤，故未做验证。在制备需测定菌落数的菌液过程中，经过实验探索本实验室每种菌的稀释级别为：金黄色葡萄球菌10-6，白色念珠菌1