食品微生物检验方法(ISOFDA)ppt课件

1、食品微生物检验方法中国检验检疫科学研讨院北京陆桥技术有限有限责任公司何艳玲内容提要菌落总数检测大肠菌群及大肠杆菌检测金黄色葡萄球菌检测沙门氏菌检测单核细胞增生李斯特氏菌检测菌落总数测定菌落总数的概念菌落总数是指在被检样品的单位分量g、容积ml或外表积cm2内，所含能于某种固体培育基上，在一定条件下培育后所生成的菌落的总数。 菌落总数测定卫生学意义断定食品被细菌污染的程度及卫生质量。及时反映食品加工过程能否符合 卫生要求，为被检食品卫生学评 价提供根据。通常以为，食品中细菌数量越多， 那么可思索致病菌污染的能够性越 大，菌落总数的多少在一定程度 上标志着食品卫生质量的优劣。 FDA BAM 菌落

2、总数测定流程 检样xg/mL+9xml稀释液磷酸盐缓冲液 适当十倍稀释样品选择23个延续适宜稀释度各取1mL分别参与灭菌平皿内每个稀释度做两个平行 每皿内参与适量平板计数琼脂PCA 35 ，48 2h菌落计数 FDA BAM 菌落计数方法选择25250CFU之间的菌落进展计数，计算公式如下： N=C/1*n1+0.1*n2*d一切平板的菌落数都缺乏25CFU，报告EAPC/mlg为25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count一切平板的菌落数都超越250CFU，但缺乏100/cm2 ，报告EAPC/mlg为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的

3、稀释度。一切平板的菌落数都超越100/cm2 ，计算平板的面积直径为90mm的平板面积为65cm2，估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/mlg为65*100* 1/d。无法计数的平板报告LALaboratory Accident。最终结果保管前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。 ISO4833-2003 菌落总数测定流程 检样xg/mL+9xml稀释液磷酸盐缓冲液 适当十倍稀释样品选择23个延续适宜稀释度各取1mL分别参与灭菌平皿内每个稀释度做两个平行 每皿内参与适量1215mL平板计数琼脂PCA， 301 ，72 3 h菌落计数

4、 假设疑心样品中含有在培育基外表蔓延生长的菌落，待琼脂凝固后，在其上覆盖一层4mL水琼脂。平板叠放不超越6个ISO4833-2003菌落计数方法选择延续2个稀释度不超越300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进展计数，计算公式如下： N=C/n1+0.1*n2*d一切平板的菌落数都缺乏15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：NE=m 固体样品： NE=md-1无菌生长：液体样品：less than 1; 固体样品：less than 1 d-1最终结果保管前两位有效数字。菌落总数测定几点阐明由于检样中采用30/35有氧条件下培育，因此并不是样品中实践的总活菌数，一些特殊营养要

5、求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的方式存在，因此在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位分量、容积或外表积内的菌落数或菌落构成单位colony forming units，CFU报告。菌落总数测定几点要求每个样品从开场稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超越15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，防止将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培育，可防止菌落蔓延生长。检样过程中运用稀释剂

6、做空白对照，用以断定稀释液、培育基、平皿或吸管能够存在的污染。同时，检样过程中应在任务台上翻开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无遭到来自空气的污染。检样稀释液有时带有食品颗粒，为防止与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培育，于4 放置，以便在计数检样时用作对照。大肠菌群的定义大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等能否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致

7、。根据进一步的生化实验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌俗称大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠杆菌的定义大肠杆菌也称大肠埃希氏菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC实验靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐实验为+-或-+-的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌ETEC、致病性大肠杆菌EPEC、出血性大肠杆菌EHEC、侵袭性大肠杆菌EIEC、黏附性大肠杆菌EAEC。大肠菌群和大肠杆菌的关系耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培育基中35/37 培育48h产酸产气，并在44.5培育24

8、h产酸产气的细菌根据ISO规范卫生学意义大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要目的，作为食品中的粪便污染目的。食品中检出大肠菌群，阐明该食品有粪便污染，既能够有肠道致病菌存在，因此也就有能够经过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，阐明了粪便污染的程度，也反映了对人体安康危害性的大小。大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染情况的监测目的和HACCP实施效果的评价目的。大肠杆菌的生物学特性根本形状： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，普通约0

9、.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链陈列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只需1-4根，普通不超越10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不构成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。大肠杆菌的生物学特性培育特性：大肠杆菌合成代谢才干强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培育基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44 条件下仍能生长，生长温度范围15-46 。 在普通营养琼脂上有3中菌落形状： 1光滑型：菌落边缘整齐，外表有光泽、潮湿、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3黏液型

10、：常为含有荚膜的菌株。大肠菌群及大肠杆菌测定 MPN法检验流程FDA BAM 检样50g+450ml稀释液 适当十倍稀释样品选择3个适宜的延续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤每管9mlLST肉汤并加有导管，每管接种1mL 35 ，24 2h 48 2h 没有产气管 有产气管 报告阴性 接种BGLB肉汤管 接种EC肉汤 35 ，48 2h 44.50.5 水浴培育 24 2h 48 2h 查MPN表报告结果 产气管接种EMB平板35、1824h 大肠菌群 从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜 面，进展革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接 种LST复检产气 查MPN表报告结果大肠

11、杆菌 大肠菌群测定MPN法检验几点阐明MPN检索表： MPN 为最大能够数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进展延续系列稀释，参与培育基进展培育，从规定的反响呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，那么表内数字应相应降低或添加10倍。初发酵和证明实验： 1两步法进展了两次乳糖发酵实验。初发酵和证明实验所用培育基不同，但都是为了证明培育物能否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持浸透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉

12、汤允许“缓慢乳糖发酵Slow lactose fermentations来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。 2初发酵阳性管，不能一定就是大肠菌群细菌，经过证明实验后，有时能够成为阴性。有数听阐明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证明实验相差较大。因此，在实践检测任务中，证明实验是必需的。产气量与倒管： 在乳糖发酵实验任务中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡有时比小米粒还小，有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有渐渐上浮的小气泡。实验阐明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充溢气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。假设对

13、产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手悄然打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应思索能够有气体产生，而应作进一步实验。 不适于用大肠菌群作为粪便污染指示菌的食品冷冻食品经射线照射处置的食品 pH较高的食品 在上述食品中大肠菌群的细菌比许多肠道病原微生物更易死亡。大肠杆菌测定EMB选择性分别鉴别EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽大肠杆菌测定EMB选择性分别鉴别EMB是一种弱选择性培育基，一些球菌也可在该培育基上生长；高压灭菌可使得美蓝复原从而使培育基的颜色呈不均一橘黄色，悄然摇动培育基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；大肠杆菌在该培育基上并不一定总是呈

14、现绿色的金属光泽；该培育基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培育细菌时都应在避光条件。菌名菌落形态大肠埃希氏菌 紫黑色，有绿色金属光泽肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深阴沟肠杆菌粉色，中心色深弗氏志贺氏菌无色鼠伤寒沙门氏菌 无色粪链球菌无色大肠杆菌测定革兰氏染色根本原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛运用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创建。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两大类。 革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和构造的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，添加了细胞壁的通透性，使初染后的结

15、晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保管初染时的颜色。大肠杆菌测定革兰氏染色Gram negativeGram positiveGram straining大肠杆菌测定革兰氏染色根本步骤：将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红

16、色。大肠杆菌测定生化鉴定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole红色环不变色+-KovacsMR红色不变色+甲基红V-P玫瑰红色环不变色-V-P甲、乙液Citrate生长不生长-I M Vi C生化实验金黄色葡萄球菌生物学特性金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8m左右，陈列成葡萄串状 ，无芽孢，无荚膜。革兰氏染色阳性，但衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，常呈革兰氏阴性。金黄色葡萄球菌生长特性金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体廓清，菌量多时呈浑浊生长。血平板上金黄色葡萄球菌呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明

17、、外表光滑，周围有溶血圈。Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌圆形突起、光滑、潮湿，颜色呈灰色到黑色，边缘淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。金黄色葡萄球菌检验方法适用性MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处置的含少量金黄色葡萄球菌的食品。直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/gml的食品。增菌培育法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。定量方法定性方法金黄色葡萄球菌检验直接平板计数法 检样50g+450mL稀释液 适当十倍稀释样品 选择23个延续适宜稀释度 汲取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL

18、、0.4mL分别涂布于 3块90mmBaird-Parker平板上做平行实验 35 ，4548 h 确证实验 报告或涂布于1块140mm平板上FDA BAM 金黄色葡萄球菌检验MPN法 检样50g+450mL稀释液 适当十倍稀释样品 选择3个适宜的延续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管10% NaCl TSB肉汤，每管接种1mL 35 ，48 2 h 从生长的管中接种1环划线于 Baird-Parker平板上 35 ，48 h 确证实验 报告含1%丙酮酸钠FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证实验1.凝固酶实验方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35

19、培育18-24h。取肉汤培育物0.3mL同0.5mL凝固酶实验兔血浆充分混合，置35培育，定时察看能否有凝块构成，至少察看6h。 实验中需同时做知阳性和阴性对照。结果断定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固2+和3+的必需进展生化鉴定加以证明。FDA BAM金黄色葡萄球菌确证实验2.革兰氏染色对一切的可疑培育物都要进展革兰氏染色。3.生化鉴定过氧化氢酶实验葡萄糖厌氧利用实验甘露醇厌氧利用实验金葡溶菌酶敏感性实验耐热核酸酶实验辅助Staphylococcus aureus on DNase AgarFDA BAM 2种葡萄球菌和微球菌的典型特性特性S. aureusS.e

20、pidermidisMicrococci过氧化氢酶+凝固酶+-耐热核酸酶+-溶菌酶+-厌氧利用葡萄糖+-甘露醇+-ISO 金黄色葡萄球菌检验MPN法 检样xg+9xmL稀释液 适当十倍稀释样品 选择3个适宜的延续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管modified Giolitti and Cantoni broth， 37 ，2448 h 从变黑或出现黑色沉淀的管中 接种1环培育物于 Baird-Parker平板上 37 ，48 h 确证实验 报告接种10mL 于10mL双料肉汤，接种1mL 于9mL单料肉汤。小心的于接种管中培育基顶部倾注一定量的水琼脂，使其凝固构成密封塞。ISO 金黄色

21、葡萄球菌确证实验凝固酶实验结果断定： - 1+ 2+ 3+ 4+ negative positive沙门氏菌属简介1880年E. Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分别出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原构造复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。 沙门氏菌属生物学特性形状特征： 革兰氏阴性，大小为130.40.9m的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，普通无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。培育特性：

22、沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 都可生长，最适生长温度为37，最适pH为6.87.8。营养琼脂平板上：3537培育1824h，其菌落大小普通为23mm，光滑、潮湿、无色、半透明、边缘整齐。血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。沙门氏菌属生物学特性沙门氏菌属的抗原菌体抗原O抗原外表抗原K抗原：Vi抗原和M抗原鞭毛抗原H抗原纤毛抗原FDA BAM沙门氏菌检验流程前增菌 25g样+225mL乳糖肉汤 肉制品、肉副产品、动物产品 匀质2min，室温放置60 5min 混合均匀，测定调理P

23、H6.8 0.2 35、24 2h选择性增菌 0.1ml+10mlMMRV 1ml+10mlTTB 42、24h 水浴培育 35、24h 43、24h水浴培育 含菌量高 含菌量低分别培育 划线接种 选择性培育基BS、XLD、HE 35、2448hBS生化鉴定 每个平板挑取至少2个可疑菌包括典型和非典型各2个 接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面LIA高层深4cm 松盖以坚持有氧条件防止产生过多H2S 35、242h 弃去 尿素酶实验 卫矛醇、 氰化钾、丙二酸钠、吲哚实验 阳性 阴性血清学 血清学实验沙门氏菌的分类 报告结果生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料ISO6579沙门氏菌检验流程前增

24、菌 25g样+225mLBPW 匀质 371、18 2h选择性增菌 0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn 41.5 1、24 3h 37 1、24 3h 水浴培育分别培育 划线接种选择性培育基XLD和第二种选择性培育基，如 BS 37、2448hBS 每个平板挑取至少5个可疑菌进展纯培育和确认实验 37、243h 生化鉴定 TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、-牛乳糖、V-P、 吲哚实验血清学 血清学实验沙门氏菌的分类 报告结果ISO6579沙门氏菌生化实验表试验沙门氏菌属伤寒A型副伤寒B型副伤寒C型副伤寒其他菌属反应%b反应%b反应%c反应%c反应%bTSI葡萄糖产酸+100+1

25、00+100TSI葡萄糖产气-d0+100+92TSI乳糖产酸-2-100-1TSI蔗糖产酸-0-0-1TSI硫化氢产生+97-10+92尿素水解-0-0-1赖氨酸脱羧酶+98-0+95-牛乳糖反应-0-0-2eV-P反应-0-0-0吲哚反应-0-0-1b：百分率表明并不是所有分离到的沙门氏菌血清型都会显示+或-的结果。c：这些百分率不能从现有的文献中获得。d：伤寒沙门氏菌不产气e：亚利桑那亚型肠炎沙门氏菌为乳糖阳性或阴性反应，但通常-牛乳糖反应阳性。沙门氏菌检验选择性分别培育XLD琼脂：FDA BAM典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培育物可呈 现大的具光泽的黑色中心或几乎为

26、全部黑色的菌落。 非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。ISO中心黑色、周围由于指示剂颜色的改动而出现红色的细微透明带。菌名菌落形态鼠伤寒沙门氏菌 红色，有黑心伤寒沙门氏菌红色，有黑心弗氏志贺氏菌红色大肠埃希氏菌 黄色，有胆盐沉淀环粪链球菌 -沙门氏菌检验选择性分别培育BS琼脂：FDA BAM典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周 围的培育基通常开场呈褐色，但伴随培育时间的延伸而 变为黑色，并有晕环效应； 非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，构成灰绿色菌落，周围培育 基不变色。菌名菌落形态伤寒沙门氏菌 黑色，有金属光泽鼠伤寒沙门氏菌 黑色，有金属光泽奇异变形杆菌褐色或呈黑色，无金属光泽弗氏志贺氏菌棕色至绿色大肠埃希氏菌 棕色至绿色粪链球菌