《植物生理学实验》word版

1、植物生理学实验实验01 植物组织中自由水和束缚水含量的测定植物组织中的水分以自由水和束缚水两种不同的状态存在。自由水与束缚水含量的高低与植物的生长及抗性有密切关系。自由水束缚水比值高时，植物组织或器官的代谢活动旺盛，生长也较快，抗逆性较弱；反之，则生长较缓慢，但抗性较强。因此，自由水和束缚水的相对含量可以作为植物组织代谢活动及抗逆性强弱的重要指标。一、原理:自由水未被细胞原生质胶体颗粒吸附而可以自由移动、蒸发和结冰，也可以作为溶剂。束缚水则被细胞原生质胶体颗粒吸附而不易移动，因而不易被夺取，也不能作为溶剂。基于上述特点以及水分依据水势差而移动的原理，将植物组织浸入高浓度（低水势）的糖溶液中一定

2、时间后，自由水可全部扩散到糖液中，组织中便留下束缚水。自由水扩散到糖液后（相当于增加了溶液中溶剂）便增加了糖液的重量，同时降低了糖液的浓度。测定此降低了的糖液的浓度，再根据原先已知的高浓度糖液的浓度及重量，可求出浓度降低了的糖液的重量。用浓度降低了的糖液的重量减去原来高浓度糖液的重量即为植物组织中的自由水的量（即扩散到高浓度糖液中的水的量）。最后，用同样的植物组织的总含水量减去此自由水的含量即是植物组织中束缚水的含量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小白菜、棉花叶片。（二）仪器设备：1.阿贝折射仪；2.分析天平或电子顶载天平（感量0.1mg）；3.烘箱；4.干燥器；5.称量瓶；6.打孔器（

3、面积0.5cm2左右）；7.烧杯；8.瓷盘；9.托盘天平（1/100g）；10.量筒。（三）试剂：重量百分浓度为6065的蔗糖溶液：用托盘天平称取蔗糖6065g，置烧杯中，加蒸馏水4035g，使溶液总重量为100g，溶解后备用。三、实验步骤1.植物组织中总含水量的测定（1）取称量瓶3只（三次重复，下同），依次编号并分别准确称重。（2）在田间选取生长一致的待测的植物数株，各选部位、长势、叶龄一致的有代表性叶子数片。用打孔器钻取小圆片150片（注意避开粗大的叶脉），立即装到上述称量瓶中（每瓶随机装入50片），盖紧瓶盖并精确称重。（3）将称量瓶连同小圆片置烘箱中105下烘15min以杀死植物组织细胞

4、，再于8090下烘至恒重（称重时须置干燥器中，待冷却后称）。设称量瓶重量为W1，称量瓶与小圆片的重量为W2，称量瓶与烘干的小圆片的重量为W3（以上重量单位均设为g，下同）。则植物组织的总含水量（）可按下式计算植物组织的总含水量（）（W2W3）/（W2W1）100根据上式可分别求出三次重复所得到的组织总含水量的值并进一步求出其平均值。2.植物组织中自由水含量的测定（1）另取称量瓶3只，编号并分别准确称重。（2）用打孔器打取小叶圆片150片（植物材料的选取同上），立即随机装入三个称量瓶中（每瓶装50片），盖紧瓶盖并立即称重。（3）三个称量瓶中各加入6065的蔗糖溶液5ml左右，再分别准确称重。（4

5、）各瓶于暗处置46h（经减压处理后，只需在暗处置1h），其间不时轻轻摇动。到预定的时间后，充分摇动溶液。用阿贝折射仪（见附注）分别测定各瓶糖液浓度，同时测定原来的糖液浓度。设称量瓶重量为W1，称量瓶与小圆片的重量为W2，称量瓶与小圆片及糖液的重量为W4，糖液原来的浓度为C1，浸过植物组织后的糖液的浓度为C2。则植物组织中自由水的含量（）可由下式算出：植物组织中自由水的含量（）（W4W2）（C1C2）/(W2W1)C2100根据上式同样可求出三个不同的测定值并进一步求出其平均值。3.植物组织中束缚水含量的计算植物组织中束缚水的含量（）组织总含水量（）组织中自由水含量（）实验02 植物组织水势的测

6、定（小液流法）一、 原理将植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，当找到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。因溶液的浓度是已知的，可以根据公式算出其渗透压，取其负值，为溶液的渗透势（），即代表植物的水势（w）（waterpotential）。wPCRT（大气压）二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小白菜或其它作物叶片（二）仪器设备：1.带塞青霉素小瓶12个；2.带有橡皮管的注射针头；3.镊子；4.打孔器5.培养皿。（三）试剂：、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L蔗糖溶液；2.甲烯蓝粉末。三、实验步骤（一）取干燥洁净的

7、青霉素瓶6个为甲组，各瓶中分别加入0.050.30mol/L蔗糖溶液约4ml（约为青霉素瓶的23处），另取6个干燥洁净的青霉素瓶为乙组，各瓶中分别加入0.050.30mol/L蔗糖溶液1ml和微量甲烯蓝粉末着色，上述各瓶加标签注明浓度。（二）取待测样品的功能叶数片，用打孔器打取小圆片约50片，放至培养皿中，混合均匀。用镊子分别夹入58个小圆片到盛有不同浓度的甲烯蓝蔗糖溶液的青霉素瓶中（乙组）。盖上瓶塞，并使叶圆片全部浸没于溶液中。放置约3060min，为加速水分平衡，应经常摇动小瓶。（三）经一定时间后，用注射针头吸取乙组各瓶蓝色糖液少许，将针头插入对应浓度甲组青霉素瓶溶液中部，小心地放出少量液

8、流，观察蓝色液流的升降动向。（每次测定均要用待测浓度的甲烯蓝蔗糖溶液清洗几次注射针头）。如此方法检查各瓶中液流的升降动向。若液流上升，说明浸过小圆片的蔗糖溶液浓度变小（即植物组织失水）；表明叶片组织的水势高于该浓度糖溶液的渗透势；如果蓝色液流下降则说明叶片组织的水势低于该糖溶液的渗透势，若蓝色液流静止不动，则说明叶片组织的水势等于该糖溶液的渗透势，此糖溶液的浓度即为叶片组织的等渗浓度四、结果计算将求得的等渗浓度值代入如下公式：wCRTi1.0130.1。式中：w植物组织的水势（单位：Mpa）溶液的渗透势C等渗浓度（mol/L）R气体常数（0.008314MPa/L/mol/K）T绝对温度i解离

9、系数（蔗糖1，CaCl22.60）1大气压1.0130.1MPa。实验03 根系活力的测定（TTC法）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水本。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。一、 原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原

10、量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂（一）材料：水培或砂培小麦、玉米等植物根系。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 电子顶载天平（感量0.1g）；4. 温箱；5. 研钵；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度试管10ml；11. 试管架；12. 容量瓶10ml；13. 药勺；14. 石英砂适量；15. 烧杯10ml、1000ml。（三）试剂：1. 乙酸乙酯（分析纯）。2. 次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。3.1TTC溶液准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到10

11、0ml。用时稀释至各需要的浓度。4. 磷酸缓冲液（115mol/L，pH7）。5. 1mol/L硫酸用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。6. 0.4mol/L琥珀酸称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、实验步骤（1）TTC标准曲线的制作取0.4TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、

12、50g、100g、150g、200g的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37下暗保温13h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参

13、比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）四氮唑还原量（mg）/根重（g）时间(h)实验04 用真空渗入法测定环境因子对光合作用的影响绿色植物的叶绿体是光合作用进行的场所，叶绿体色素是进行光合作用光能吸收、传递与转换的主要物质，与作物光合作用及产量形成关系密切。不同作用作物叶绿素的含量与组成有差异，栽培措施、营养状况等条件的改变都会通过影响叶绿体色素的状况而影响光合。了解叶绿体色素的组成与含量，无论对于深入理解光合作用的本质，还是对于作物育种与制定合理的栽培措施都具有重要意义。一、原理真空渗入法可使叶肉细胞间隙充满水分而下沉。在光合作用

14、过程中，植物吸收CO2而放出氧气，由于氧在水中的溶解度很小，所以光合作用的结果，会使得下沉的叶片随其下表面气体逐渐增加而上浮，根据上浮所需的时间的长短，即能推测光合作用的强弱。二、材料、仪器设备及试剂1. 小白菜、莴苣叶片；2. 直径约1cm的打孔器；3. 注射器；4. 三角瓶；5. 小烧杯；6.温度计；7. 冰块。三、实验步骤1. 从供试植物上，选取生长健全、年龄近似、厚薄均匀的成长叶片数片，用直径约1厘米的打孔器打小圆片50片左右，放入注射器中，加水使叶子浸没。在排出空气后用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气。轻放活塞，水液即进入组织。如此反复抽拉几次，叶

15、片即可变成半透明状而下沉，把下沉叶子连水倒入小烧杯中，放于黑暗处。2. 取100ml三角瓶四个，编号后，在各瓶中均加入新制冷开水40ml，再向2，3，4号瓶中各加入相当于麦粒大小的碳酸氢钠粉末于水中令充分溶解，在2号瓶上用较厚白纸遮光，3号瓶用冰水降温至10左右，1，2，4号瓶则用温水浴保持2025的温度。每瓶各放入下沉叶片10片，放在日光或较强灯光下进行光合作用。3. 记录各瓶内叶片上浮所需平均时间，或一定时间内上浮叶片数实验05 叶绿体色素的提取、分离一、原理叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色

16、素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：菠菜、小白菜叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 漏斗；3. 三角瓶；4. 剪刀；5. 滴管；6. 培养皿（直径11cm）；7. 康维皿或平底短玻管；8. 圆形滤纸（直径11cm）；（三）试剂：1. 95乙醇；2. 石英砂；3. 碳酸钙粉；4. 推动剂：按石油醚；丙酮：苯（10:2:1）比例配制（V

17、V）。三、实验步骤1. 叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片45片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。（2）研钵中加23ml95乙醇，研磨至糊状，再加1015ml95乙醇，提取35min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml95乙醇冲洗，一同滤于三角瓶中。（3）如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105杀青，再在80下烘干，研成粉末，密闭贮存。用时称叶粉2g放入小烧杯中，加95乙醇2030ml浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。2. 叶绿体色素的分离：（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（

18、直径约3mm）另取一张滤纸条（5cm1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。（3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。如无康维皿，也可在培养皿中放入一平底短

19、玻管或塑料药瓶盖，以盛装推动剂。所用培养皿底、盖直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。实验06 叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即ACL式中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数

20、。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.

21、01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。（三）试剂：96乙醇（或80丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。三、实验步骤1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置35min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管

22、吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A6656.88A649；Cb=24.96A6497.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重（或干重）。实验07 希尔反应的观察一、原

23、理希尔反应（Hillreaction）是绿色植物的离体叶绿体，在光下分解水放出氧气同时还原电子受体的反应。氧化剂2，6-二氯酚靛酚是一种蓝色染料，接受电子和H后被还成无色，可以直接观察颜色的变化也可用分光光度计还可以对还原量进行精确测定。二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：菠菜或其它绿色植物新鲜叶片。 （二）仪器设备：1. 研钵；2. 石英砂；3. 小试管；4. 试管架；5. 漏斗；6. 纱布；7. 小烧杯；8. 剪刀。（三）试剂：0.12，6-二氯酚靛酚三、实验步骤 取新鲜的菠菜或其它植物叶片0.5g，剪碎后放入研钵中，研磨成匀浆。加50ml蒸馏水，通过56层纱布，过滤到小烧杯中，即得到叶

24、绿体粗悬浮液。取试管两支。每管中加入叶绿体悬浮液5ml，0.12，6-二氯酚靛酚溶液56滴，摇匀。将其中一管置于直射光下，另一管置于暗处，注意日光下的试管液颜色变化。58min后，将置于暗处的试管取出，比较两管溶液颜色变化，并解释原因。实验08 核酮糖1，5二磷酸羧化酶活性的测定核酮糖1，5二磷酸羧化酶（ribulose1，5bisphosphatecarboxylase，RuBPCase）是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中最丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白5060。本实验用分光光度法测定酶的羧化能力。一、原理： 在RuBPCase的催化下，1分子的核酮

25、糖1，5二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3磷酸甘油酸（PGA），PGA可通过外加的3磷酸甘油酸激酶和甘油醛3磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛3磷酸，并使还原型辅酶I（NADH）氧化.因此，由辅酶I氧化的量就可计算RuBPCase的活性，由340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶I氧化的量。为了使NADH的氧化与CO2的固定同步，从而需要加入磷酸肌酸（CrP）和磷酸肌酸激酶的ATP再生系统。ADPCrP磷酸肌酸激酶ATPCr二、材料、仪器设备（一）材料：菠菜叶片、小麦及水稻叶片。（二）仪器设备：1. 紫外分光光度计；2. 冷冻离心机，3. 匀浆器；4. 移液管；5. 秒表。（三）试

26、剂：1. 5mmolLNADH；2. 25mmol/L RuBP；3. 0.2mol/L NaHCO3；4. RuBPCase提取介质：40mmol/L（pH7.6）TrisHCl缓冲溶液，内含10mmol/L MgCl2、0.25mmol/L EDTA、5mmol/L 谷胱甘肽；5. 反应介质：100mmol/L TrisHCl缓冲液，内含12mmol/L MgCl2和0.4mmol/L EDTA-Na2，pH7.8；6. 160u/ml 磷酸肌酸激酶溶液；7. 160u/ml 甘油醛3磷酸脱氢酶溶液；8. 50mmol/L ATP；9. 50mmol/L 磷酸肌酸；10. 160u/ml

27、磷酸甘油酸激酶溶液；11. 菠菜的RuBPCase提取液。三、实验步骤1. 酶粗提液的制备取新鲜菠菜叶片10g，洗净擦干，放匀浆器中，加入10ml预冷的提取介质，高速匀浆30S，停30S，交替进行3次；匀浆经4层纱布过滤，滤液于20000g 4下离心15min，弃沉淀；上清液即酶粗提液，置0保存备用。2. RuBPCase活力测定按下表配制酶反应体系3. 反应介质4. 将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值。将0.1mlRuBP加于比色杯内，并马上计时，每隔30S测一次吸光度，共测3min。以零点到第1min内吸光度下降的

28、绝对值计算酶活力。由于酶提取液中可能存在PGA，会使酶活力测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBP的对照。对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取液放在最后加，加后马上测定此反应体系在340nm处的吸光度，并记录前1min内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量。四、结果计算RuBPCase的酶活力（mol/ml酶液/min）AN10/(6.222dt)式中：A反应最初1min内340nm处吸光度变化的绝对值（减去对照液最初1min的变化量）；酶活力为每min每ml酶液固定CO2mol数；N稀释倍数6.22每molNADH在340nm处的吸光系数；2表示每

29、固定1molCO2有2molNADH被氧化；t测定时间为1mind比色光程（cm）。实验09 红外线CO2气体分析仪法测定植物光合速率与呼吸速率红外线CO2气体分析仪（IRGA）工作原理：许多由异原子组成的气体分子对红外线都有特异的吸收带。CO2的红外吸收带有四处，其吸收峰分别在2.69m、2.77m、4.26m和14.99m处，其中只有4.26m的吸收带不与H2O的吸收带重叠，红外仪内设置仅让4.26m红外光通过的滤光片，当该波长的红外光经过含有CO2的气体时，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并服从朗伯比尔定律。分别供给红外仪含与不含CO2的气体，红外仪的检测器便可

30、通过检测红外光能量的变化而输出反映CO2浓度的电讯号。.密闭系统斜率法一、原理把IRGA与光合作用同化室连接成密闭的气路系统。将植物材料密封在透明的同化室内，给以适当的光照，同化室内CO2浓度将因植物光合而下降，用IRGA配以适当的记录仪可绘出同化室内CO2浓度随光合时间下降的曲线。在同化室不漏气、光强度稳定、室内空气不断得到搅动的情况下，该曲线将是一条平滑曲线，在曲线的任一点作切线，即可根据切线的斜率，密闭系统的容积和同化室面积求出在该点的CO2浓度下的光合速率。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片（二）仪器设备：1. 密闭气路光合测定装置：将QGD07型红外线CO2气体分析仪、XW

31、T264型自动记录仪、MXQ型气体取样器（图4）、光合作用同化室、温度转换器（测温探头可放在同化室内，输出信号接记录仪）或半导体点温计、橡皮管（内径67mm）、塑料气球，按图6所示连接成套，放在一辆医用小推车上。2. 量子辐射照度计；3. 叶面积仪；4. 铁架台（带试管夹）；5. 050温度计（用以校正叶室温度）；6. 剪刀；7. 带盖搪瓷盘；8. 纱布。（三）试剂：1. 无水氯化钙（无水硫酸钙）；2. 烧碱石棉（10目）或碱石灰。三、实验步骤（一）光合速率的测定1. 安装仪器（1）将安装好的密闭气路光合测定装置安放在靠待测植株12m处，接通红外仪、录仪、取样器、温度转换器的供电电源。打开红外

32、仪电源开关预热12h，红外仪量程开关置于I档（0500ppm，1ppm1mg/L）。把红外仪和温度转换器的信号输出与记录仪的两个信号输入接线柱用导线接通。旋转记录仪第一支笔量程选择开关于10mV位置（与红外仪输出信号电压匹配），旋转记录仪第二支笔量程选择开关于2V位置（与温度转换器输出温度050信号电压匹配）。2. 调、校仪器（1）红外仪预热完毕后，开启记录仪电源开关、记录仪信号输入开关和取样器前面板上的气泵开关，将取样器F1旋钮置“零气”位置，F2旋钮置“测量”位置，开始调整红外仪的零点（此时，无CO2无水分的零气循环经过红外仪），约12min，调节红外仪的调零旋钮使指针稳定在“0”点位置，

33、稳定后，调节记录仪第一支笔的“调零”旋钮使记录笔到零点位置，红外仪调零完毕。（2）拔下红外仪进气口处的橡皮管，改接CO2标准气（已知准确CO2浓度）钢瓶，出口放空，让标准气流经红外仪分析气室（流量以1Lmin左右为宜）开始校正，此时红外仪指针应指在标准气浓度所对应的刻度（A值）上，否则可调节红外仪“校正”旋钮，校正完毕后恢复原气路。（3）把玻璃温度计感温端与叶室内的温度转换器探头放在一起（注意遮荫），从玻璃温度计上读出温度，迅速旋转记录仪第二支笔的调零旋钮，使记录笔置该温度所对应的位置，校正温度。3. 测定（1）旋转取样器面板上F1旋钮至“测量”位置，把植物叶片平展放入同化室后关闭同化室（注意

34、勿让操作者的呼吸气进入叶室），开启叶室风扇。观察记录笔开始左移时，迅速旋转记录仪“走纸变速”开关至合适档（以所划曲线45角为宜），开始记录CO2浓度变化（此时记录笔应从350ppm左右开始记录）和温度变化，用铅笔在记录纸上记下所测叶片的编号、走纸速度，用量子辐射照度计测量所测叶片的受光强度（光子通量密度）并记录，待记录笔左移至310ppm左右时，关闭走纸开关，停止记录，第一次测定完毕。（2）旋转取样器面板上的F2旋钮至“补充”位置后，迅速复原，让气球内的高浓度CO2气进入同化室以补充CO2浓度至350ppm左右，观察记录笔左移后迅速开启走纸开关，进行第二次重复测定，测量光照强度并记录，当记录笔

35、左移至310ppm左右时，关闭走纸开关，第二次重复测定完毕。如此再进行第三次重复测定。（3）三次重复测定完毕后，关闭同化室内风扇，用记号笔在叶片的叶室内外相交处作标记，打开叶室，剪下叶片的测定部分，用纸牌编号后包在湿纱布内并放置于带盖搪瓷盘内，待测叶面积。然后再测定第二张叶片的光合速率。（4）测定结束后，用叶面积仪测定各叶片面积（如有便携式叶面积仪，可在测定光合后，立即测出叶面积）。 4. 计算II.密闭系统落差法原理在密闭的系统中，由于同化室中的叶片进行光合后，系统中的CO2浓度不断下降，可用单位时间内同化室中CO2浓度的减少量或CO2浓度减少量所需的时间，根据叶片面积、同化室体积，计算光合

36、速率。二、材料、仪器设备及试剂材料：待测植物叶片。（二）仪器设备：1.GXH305型红外线CO2气体分析仪（或QGD07型红外仪，使用该红外仪需要配用MXQ气体取样器和数字万用电表）；2.电子秒表；3.同化室（根据需要自制，内装两个小风扇和一个测定温度的传感器）；4.量子辐射照度计。（三）试剂：烧碱石棉或碱石灰。三、实验步骤1. 按要求将气路系统的各部分连接起来，若使用QGD07型红外仪，把数字万用电表上选择开关旋至200mV电压档上，与红外仪0200mV输出相连接。2. 接通电源，打开红外仪电源预热12h，打开气泵电源，旋转零气调节开关至“零点”上，此时红外仪通入无CO2气体，调节红外仪“调

37、零”旋钮，显示在“零点”位置，并观察零点的稳定性。3. 将待测叶片放入同化室，密闭后开启同化室内的风扇，当CO2浓度稳定下降时，开始测定，读取开始的CO2浓度值C1，开始计时，CO2下降至C2（约下降2030ppm），终止计时，记录C1、C2、t（或确定从测定开始到结束所需时间），并同时用照度计测定光照强度，测定叶室内的温度。一次测定完成之后，向同化室内补充CO2，进行重复测定（使用MXQ取样器，补充CO2操作见密闭气路斜率法）。测定结束，用叶面积仪测量叶片的面积。4. 计算光合速率PnCV273P/tS22.4(273t)0.1013上式中，Pn光合速率（单位mol/m2/s）；CCO2浓度

38、落差C1C2（ppm）；t测定时间（S）；S叶片面积（单位m2）；V同化室（包括气路系统）体积（单位L）；t同化室的温度；P大气压（单位Mpa）。密闭气路落差法测定装置除了进行光合速率测定外，也能够进行呼吸速率、CO2光合速率曲线的测定。测定步骤同光合速率测定方法。更换群体同化箱，可以进行群体光合速率的测定，测定步骤略。实验10 叶绿体光诱导荧光强度的测定一、原理叶绿体色素在照光时能辐射出荧光。研究叶绿体色素荧光性质，有助于了解它的分子激发态，分子之间的能量传递以及分子在活体内的排列。叶绿体光诱导荧光强度的变化（以下简称可变荧光）是由于叶绿体吸收光能后，光能在转化和电子传递过程中受阻，能量不能

39、正常的传递下去，而以荧光的形式释放出来，使荧光的强度增加。如果这种变化是由光的影响引起的，就叫光诱导的可变荧光。当然，也可由其它条件诱导的可变荧光。在室温条件下，叶绿体在685nm处呈现一个荧光发射峰，它是由光系统II发射出来的，这部分荧光称为固定荧光（F0），是物理性的，它与光系统II的原初反应和电子传递无关当对叶绿体进行光诱导时，而发射出的荧光叫可变荧光（F）。固定荧光和可变荧光之和称为总荧光（Fmax）。由此可见，可变荧光（F）可以代表光系统II反应中心可能利用及转化能量的能力。所以，F在一定程度上代表光系统II反应中心的活性。而可变荧光与固定荧光的比值则表示光系统II的光能转换效率。因

40、此，可作为叶绿体光化学活性的一个重要指标。二、材料、仪器设备及试剂材料：玉米、菠菜叶片仪器设备：1.冰箱；2.组织捣碎机；3.冷冻离心机；4.玻璃匀浆器；5.动力学分光光度计。（三）试剂：叶绿体制备缓冲液（简称制备液）。0.05mol/L 磷酸缓冲液，内含0.3mol/L 蔗糖和0.1mol/L KCl，pH7.2。三、实验步骤1. 叶绿体的制备称取10g弃去大叶脉的新鲜植物叶片，先用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，吸干水分后，放在冰箱里冷冻。然后用剪刀剪碎，置于预冷的组织捣碎机的玻璃缸内，加入50ml制备液，用4层纱布将匀浆过滤，滤液在0下用1000g离心10min。弃去上清液，在沉淀中加入40

41、ml制备液悬浮，再次用1000g离心10min，取出沉淀，用15ml制备液在玻璃匀浆器内匀浆，则得叶绿体悬浮液备用。2. 将仪器调整好，并把必要的参数调到预定值，使仪器运转正常。在光电倍增管前加一个684nm的滤光片，并把激发光波长调到436nm或480nm。3. 调整基线将空白缓冲液倒入比色杯中，放入样品室的样品架上，打开激发光谱录基线，如果信号过大，说明滤光片漏光，需更换。4. 样品测定将待测的叶绿体样品放入比色杯，并放到样品室内。打开激发光，记录固定荧光。再打开诱导光，记录最大荧光强度（Fmax）。四、结果计算：根据记录的图谱，计算出固定荧光（F0）和总荧光（Fmax）的数值，并按下述公

42、式计算可变荧光和可变荧光产率。可变荧光FFmaxF0；可变荧光率F/F0实验11 微量定容测压法测定植物的呼吸速率一、原理微量检压计不仅用来研究有机体或部分组织的呼吸作用和发酵作用，而且也可以研究有关O2与CO2及其它气体交换的反应。如光合作用，酶的活性等。测压法的原理是在固定体积并保持恒温的密闭系统中，气体产生或消失的总量，可以利用气体定律计算求得。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：待测的小麦、水稻萌发种子。（二）仪器设备：1. 瓦布格呼吸计（微量呼吸检质计）；2. 移液管；3. 量筒；4. 小镊子；5. 称量瓶。（三）试剂：1. 20KOH；2. 凡士林；3. 橡皮筋数根；4. 吸水纸；

43、5. Brodie氏溶液：NaCl 23g，牛胆酸钠5g，溶于500ml水中，另加少许染料（酸性品红）使溶液染色，并加数滴浓麝香草酚酒精溶液作为防腐剂。三、实验步骤 （一）种子吸氧量的测定1. 取不同处理种子若干（体积约0.5ml左右），称其鲜重，然后用排水法测定其体积，先用滤纸将种子外面水分吸干，另取10ml量筒一个，内盛45ml的水，将种子放入量筒内观察水分上升体积，二次水分体积之差即为种子体积，将种子取出，用滤纸吸干附在种子外表的水分，然后将种子放入反应瓶的底部，再加0.5ml水2. 在中央小槽内加入20KOH0.2ml，为了增大吸收CO2的能力，可用12cm滤纸折叠后插入中央小槽内。并

44、在中央小槽口上涂上少量凡士林，防止碱液逸出。3. 侧管的玻璃棒涂以凡士林后塞紧。压力计口亦涂上凡士林和反应瓶连接，转动反应瓶，使封口凡士林呈透明为止，然后用橡皮筋将反应瓶固定在压力计上。4.将压力计固定在水槽上，并打开活塞，平衡1015min，在此过程中要检查反应瓶是否漏气。（二）空白试验（作温压计用）：因压力计左管口是与大气相通，实验时室内气压或水槽温度微小变化对读数均有影响，为此，必须进行校正。校正方法：即反应瓶中除不加种子外，其他处理与测压计完全相同。（三）测定：当反应瓶内温度与水槽温度平衡后，将压力计上的活塞关闭。开始振荡。并记录开始时间，每隔15min记录测压计及温压计左管液面高度，

45、读数时关闭振荡器，并将压力计的右管液面调至150mm处，再记录左管液面高度，共计四次（共1h，读数时不能将活塞打开！）将结果按下表记录。四、结果计算（一）求K值（二）根据实际压力差值（h1.求氧的吸收量（l）hK；计算呼吸速率（耗O2）呼吸速率（l/g/h）hK/样品重(g)时间(h)实验12 小篮子法（广口瓶法）测定植物的呼吸速率一、原理植物进行呼吸时放出CO2，计算一定的植物样品在单位时间内放出CO2的数量，即为该样品的呼吸速率。呼吸放出的CO2可用氢氧化钡溶液吸收，实验结束后用已知浓度的草酸溶液滴定剩余的碱液，从空白和样品二者消耗草酸溶液之差即可计算出呼吸过程中释放的CO2的量。二、材料

46、、设备仪器及试剂（一）材料：发芽的小麦种子或其它萌发的种子。（二）仪器设备：1.呼吸测定装置；2.天平；3.钟表；4.酸式及碱式滴定管；5.温度计（三）试剂：1. 0.05mol/L 左右的Ba（OH）2：称取Ba（OH）2 8.6g溶于1000ml蒸馏水中；2. 144mol/L 草酸溶液：准确称取重结晶的H2C2O4.2H2O 2.8651g溶于蒸馏水中定容至1000ml，每ml相当于1mgCO2；3. 酚酞指示剂：1g酚酞溶于100ml 95乙醇中，贮于滴瓶中。三、实验步骤1. 取500ml广口瓶一个，瓶口瓶用打有三孔的橡皮塞塞紧，一孔插一盛碱石灰的干燥管，使呼吸过程中能进入无CO2的空

47、气，一孔插温度计，另一孔直径约1cm，供滴定用，平时用一小橡皮塞塞紧，瓶塞下面挂一铁丝纱小篮，以便装植物样品，整个装置即谓“广口瓶呼吸测定装置”。 2. 在瓶口准确加入约0.05mol/L 的Ba(OH)2溶液20ml，立即塞紧橡皮塞（不带小篮），充分摇动广口瓶2min，待瓶内CO2全部被吸收后，拔出小橡皮管塞，加入酚酞指示剂2滴，把滴定管插入孔中，用标准草酸溶液进行空白滴定，直到红色刚刚消失为止。3. 倒出废液，用无CO2的蒸馏水（煮沸过的）洗净后，重加上述Ba（OH）2溶液20ml，同时称取植物样品510g，装入小篮子中，挂于橡皮塞下，塞紧瓶塞，开始记录时间，经过2030min，其间轻轻摇

48、动数次，使溶液表面的BaCO3薄膜破坏，有利于充分吸收CO2。然后用草酸滴定，方法如前。（注意：防止口中呼出的气体浸入瓶内！）四、结果计算呼吸速率（mgCO2/g(FW)/h）（AB）1/(Wt)上式中，A：空白滴定用去的草酸量（ml）；B：样品滴定用去的草酸量（ml）；W：样品鲜重（g）；t：测定时间（h）。每毫升144mol/L 的草酸相当于1mgCO2。实验13 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分

49、子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，

50、再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。四、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。（二）取50m

51、l三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。五、结果酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）（AB）VT/(WVS1.7t)式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO44相当于1.7mgH2O2。实验14 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧

52、化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反

53、应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（三）试剂1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750mol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100mol/L EDTANa2溶液：称取0.03721gEDTANa2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20mol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预

54、冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.52ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750mol/L NBT溶液0.375mol/L 100mol/L EDTANa2液0.310mol/L 20mol/L 核黄素0.320mol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1

55、支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性(AckAE)V/(Ack0.5WVt)上式中，SOD比活力SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白g鲜重。

56、实验15 淀粉酶活性的测定一、原理淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3氨基5硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种

57、子淀粉酶活性最强，主要是和淀粉酶。淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而淀粉酶不耐热，在7015min则被钝化。根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。本实验采用加热钝化淀粉酶测出淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（）比较，求出淀粉酶的活力。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴（37，70，100）；4.具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。（三）试剂（均为分析纯）：1. 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml

58、；2. 3，5二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；4.1淀粉溶液：称取1g淀

59、粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。三、实验步骤（一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线.（二）酶液制备：称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520min，每隔数min搅动1次，使其充分提取。然后在3000rpm下离

60、心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。（三）酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）进行操作。 （四）结果计算：淀粉酶活力=CVT/(WVsT)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。实验16 植物过氧化物酶同工酶测定（凝胶园盘电泳）凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同的一组酶