药物分析教学课件：第五章 体内药物分析

1、定义：是指体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢物或内源性生物活性物质的定量分析。第五章 体内药物分析体内样品的特点：1、采样量少2、待测物浓度低3、干扰物质多第五章 体内药物分析体内药物分析的特点：1、体内样品需经分离与浓集，或经化学衍生化处理后才能进行分析2、对分析方法的灵敏度及专属性要求较高3、分析工作量大测定方法：色谱分析法，免疫分析法和生物学方法。一、常用体内样品的制备与贮藏 二、体内样品分析的前处理第五章 体内药物分析一、体内样品的种类生物样品器官、组织体液血液、尿液、唾液、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等第一节 常用体内样品的制备与贮藏 二、体内

2、样品的采集和制备（一）血样血浆、血清和全血 体现药物浓度和治疗作用之间的关系。 最常用的生物样本。1.血样的采集：注射器 、毛细管眼眶采血、静脉插管手术、 滞留针股静脉取血 动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。2.血样的制备： 测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。 血浆（ plasma ）的制备静脉血25003000r/min离心510min血浆置含抗凝剂试管中抗凝剂： 肝素（最常用）、EDTA、枸橼酸盐、草酸、 氟化钠。二、体内样品的采集和制备2.血清（ serum ）的制备静脉血25003000r/min离心510min置无抗凝剂试管

3、中37C or 室温放置3060min拨去血饼血清 血浆比血清的分离快，而且制取的量约为全血的50%60%，血清只为全血的20%40%，多数研究者用血浆进行分析测定。二、体内样品的采集和制备3.全血（ whole blood）的制备静脉血置含抗凝剂试管中保持血浆和血细胞的匀相状态全血 应用：若需专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度；血浆内药物浓度波动太大，且难以控制二、体内样品的采集和制备 血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测。最常用的生物样本。二、体内样品的采集和制备（二）尿样 体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型、相及相代谢物等多种形式排出。尿液的采集

4、 用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定。尿液的采集 1.尿样的特点尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，但易受食物种类、饮水多少、排汗情况的影响。（二）尿样一般以某一段时间或单位时间内尿中药物的总量（排泄量或排泄率）表示。尿液的采集 2.尿样的采集：测定方式测定一定时间内排入尿中的药物总量样本采集时间尿（在规定时间区间内采集）, 并测量每次收集的尿液体积。（二）尿样采集的尿是自然排尿。尿包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。（三）唾液（saliva） 一些药物的唾液药浓(S）与血浆游离药浓（P）密切相关，因此：TDM中利用对S的测定代替

5、对P的监测药代动力学的研究1.唾样的采集： 在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)。物理法(口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等)化学法(将柠檬酸或维生素C等置于舌尖)弃去初始部分后采集（三）唾液（saliva）2.唾样的制备 唾样采集后，立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存。（三）唾液（saliva）用于在药物的动物试验及临床上由于过量服用药物而引起的中毒死亡时，为药物的体内动力学过程提供重要信息。常用的组织：胃、肝、肾、肺、心、脑等1.组织样品的制备：制成匀浆溶液2.组织样品的处理：沉淀蛋

6、白法；酸水解或碱水解；酶水解法（四）组织可用于体内微量元素的含量测定；也可用于用药史的估计、临床用药物和非法滥用药物的甄别以及1.头发样品的采集：微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量最高，应从枕部取样，采集时从发根部（靠近头皮约1cm处)，剪取0.5-1g的头发（五）头发2.头发样品的洗涤：丙酮-水-丙酮3.头发样品的处理：直接甲醇提取；酸水解（0.1mol/L盐酸）；碱水解（1mol/L氢氧化钠）；酶水解（最常用）。（五）头发三、体内样品的贮存与处理(一）最常用的方法冷藏或冷冻冷藏冰箱(4)中短期保存(12d) 冷冻冷柜(-20)或低温冷柜(-80)中长期保存 冷藏或冷冻的时限：经稳

7、定性考察后确定1、血样的贮藏 采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后置硬质玻璃试管中或EP管中完全密塞后再贮存。三、体内样品的贮存与处理2、唾液样品的贮藏 测定唾液pH时应在取样的当时测定。 为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4以 下保存 冷冻保存唾液时，解冻后应用前摇匀。三、体内样品的贮存与处理3、尿样的贮藏 采集后应立即测定（24h），若不能立即测定，加入防腐剂后保存。保存时间为2436h(4)或长期(-20)三、体内样品的贮存与处理（二）去活性 为防止含酶样品在采样后酶对待测组分进一步代谢，采样后必须立即终止酶的活性。常采用的方法：液氮中快速冷冻、微波照射、匀浆及沉淀、加入酶活性阻断剂（如氟

8、化钠、四氢尿苷、三氯醋酸）或抗氧化剂（如维生素C等）、样品煮沸。三、体内样品的贮存与处理第二节 体内样品分析的前处理1. 生物样品分析前处理的目的 在测定体内药物及其代谢物时，首先需对复杂的生物样品实施分离、净化、浓集、化学衍生化等样品预处理过程为药物的最终测定创造良好条件。(1) 使待测药物游离测定药物的总浓度(2) 使样品纯化消除生物基质中内源性物质的干扰(3) 提高检测灵敏度适应和符合测定方法要求的灵敏度(4)防止分析仪器的污染和劣化提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果1. 体内样品预处理的目的 二.常用体内样品预处理的技术生物样品的预处理大致分为以下五类 （1）去除蛋白质（2）缀合物的

9、水解（3）分离、纯化与浓集（4）化学衍生化 （5）有机破坏法（一）去除蛋白质法目的：结合型药物释放、减少乳化的产生、保护仪器 常用方法：1 溶剂沉淀法蛋白质脱水沉淀2 中性盐析法“盐析”沉淀蛋白质3 强酸沉淀法与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀4 热凝固法蛋白质受热变性1.溶剂沉淀法常用的有机溶剂乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃等血样与溶剂的体积比1(1-3)除去90% 以上蛋白质离心分离高速(15000 g)离心5min上清液pH pH8.59.5常用中性盐饱和(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、NaCl、Na3PO4等试剂用量血样与饱和(NH4)2SO4的比例为 12

10、时除去90%以上的蛋白质离心分离高速离心2min上清液pH pH7.07.72 中性盐析法3 强酸沉淀法常用的强酸10%三氯醋酸、6%高氯酸、 5%偏磷酸等试剂用量血清与强酸的比例为10.6时除去90%以上的蛋白质离心分离高速(10000r/min)离心12min上清液pH pH 04当待测物热稳定性好时可采用。通常可加热至90，只能除去热变性蛋白。4 热凝固法目的：1、消除内源性物质、代谢物及其他共存物质的干扰；2、提取浓缩待测物质，使其易于检测（二）分离与浓集液-液萃取法(传统的方法)固相萃取法(液固萃取法)自动化固相萃取固相微萃取超滤微透析技术方法：（二）分离与浓集（1）溶剂的选择试验成

11、功的主要条件考虑：提取效率和选择性； 操作是否方便1 液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)（二）分离与浓集（1）溶剂的选择相似相溶原则 对药物的未电离分子可溶、电离形式分子不溶沸点低、易挥发与水部相混溶无毒、不易燃烧具有较高的化学稳定性和惰性不影响紫外检测1 液液萃取法液-液萃取的溶剂溶剂紫外截止波长(nm)沸点（）极性增加正己烷21069环己烷21081乙醚22035三氯甲烷24561乙酸乙酯26077正丁醇215118 萃取次数通常为1次(萃取R在70%以上) 必要时23次(萃取R在50%以下) 每次用量和水相的体积比通常为1:1或25:1 萃取方式涡流

12、混合（2）溶剂的用量1 液液萃取法（3）水相pH值水相pH值药物的pKa确定90%以上的非电离形式碱性药物最佳pH值：高于pKa值12个 pH单位酸性药物最佳pH值：低于pKa值12个pH单位一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值 介质中提取； 生物样品宜在碱性或近中性提取生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取1 液液萃取法2. 固相萃取法（Solid-phase extraction, SPE） SPE原理将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适

13、当溶剂洗脱药物。 洗脱方式A: 药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱B: 杂质与固定相亲和力比药物强，药物被直接洗脱 通常为A模式 固相的选择原则固相与被测组分应具有相似的极性SPE的填料种类繁多，可分成三类1）亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）2）亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）3）离子交换型2. 固相萃取法（Solid-phase extraction, SPE） 试验步骤五步1）用甲醇活化填料2）用水或适当的缓冲液冲洗小柱除去残留的甲醇3）加样使样品经过小柱，弃去废液4）用水或适当的缓冲液冲洗小柱除去残留的干扰物5）选择适当的洗脱溶剂冲洗小柱洗脱被分

14、析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析 方法特点 优点：1）引入杂质少 2）完全避免乳化的形成 3）较高萃取率、重现性较好 4）使用溶剂多数与水混溶，易于自动化 缺点：1）价格昂贵 2）技术要求高2. 固相萃取法（Solid-phase extraction, SPE）是以多孔性半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术。特点：不引入化学试剂、没有相态变化、对待测药物的破坏性小血液中游离药物的测定可采用分子量截留值在5万左右的超滤膜，用加压过滤法或用高速离心法获得。3. 超滤法（ultraflitration）(三）缀合物的水解药物或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物称为缀

15、合物。内源性物质有葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等。尿中药物多数呈缀合状态。缀合物极性较原形药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。(三）缀合物的水解1、酸水解：加入适量的盐酸溶液，至于酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件，随药物不同而异。该法简单、快速，但有些药物会发生水解，专一性较差(三）缀合物的水解2、酶水解法：适用于遇酸及受热不稳定的药物。常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶。一般控制pH4.5-5.5,37培育数小时进行水解。酶水解专属性强，但时间较长，酶制剂可能带入黏蛋白导致乳化或色谱柱阻塞。(三）缀合物的水解3、溶剂解法： 通过加入溶剂在萃取过程中被分解。（四）化学衍生化某些药

16、物或代谢物极性大、挥发性低或对检测器不够灵敏，使常规的HPLC或GC难以有效测定需衍生化。药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化如R-COOH、R-OH、R-NH2、R-NH-R 1.GC法中的化学衍生化目的：a: 使极性药物变成非极性、易挥发药物；b: 增加药物的稳定性c: 提高对光学异构体的分离能力主要衍生化反应：a: 烷基化b: 酰化c: 硅烷化应用最广泛d: 不对称衍生化：使对映异构体药物生成非对映异构体衍生物1.GC法中的化学衍生化2. HPLC法中的化学衍生化(1)目的：a: 提高对样品的检则灵敏度b: 改善色谱分离效果(2)化学衍生反应的要求a.反应条件不苛刻、能迅速定量进行b.生成单一衍生物，反应副产物、包括过量的衍生试剂不干扰被测样品的分离和检测c.衍生试剂方便易得、通用性好2. HPLC法中的化学衍生化柱前衍生法：是在色谱分离之前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测。(3)衍生化分类柱后衍生法：是在色谱分离(出柱)后，色谱流出组分直接在系统中与衍生试剂及辅助反应液进行反应，在线检测衍