生物技术制药：代谢工程研究进展

1、代谢工程研究进展目录1234代谢工程概述青蒿素代谢工程L-色氨酸菌种选育代谢工程展望1代谢工程代谢工程（metabolic engineering）是指利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造、改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。目的在于构建具有新的代谢途径、能生产特定的目的产物或具有过量生产能力的工程菌，用于工业生产。代谢工程的三种设计改变代谢流扩展代谢途径转移或构建新的代谢途径123基因工程手段使发生代谢转移或克隆引入外源基因使原来的代谢途径向后延伸，生成新的末端产物加速限速反应；改变分

2、支代谢途径流向；构建代谢旁路；改变能量代谢途径2青蒿素代谢工程青蒿素代谢工程是植物基因工程研究领域热点之一，转基因技术超表达青蒿素生物合成途径关键酶基因、抑制支路重要基因表达、重构青蒿素及其中间体代谢途径、增加前体供应等代谢工程方法已取得较好的进展。超表达青蒿素生物合成途径关键酶基因1利用转基因技术提高青蒿中青蒿素的量是行之有效的策略2紫穗槐-4, 11-二烯合成酶（ADS）是由FPP合成青蒿素的关键酶参与青蒿素生物合成的细胞色素P450基因CYP71AV1 (编码紫穗槐二烯C-12氧化酶)3靶点基因的选择在青蒿代谢工程研究中起到了至关重要的作用ADS基因、CYP71AV1基因、IPI 基因、

3、FPS 基因、HMGR基因等4 青蒿素的量有不同程度的提高 抑制支路重要基因表达1抑制旁路基因促可进代谢流朝靶标产物积累2反义 RNA 技术或 RNAi 技术，降低特定代谢途径上重要基因的表达3下调鲨烯合酶基因 SQS 表达，青蒿素生物合成途径的 ADS、CYP71AV1 及 CPR 基因表达得到大幅度提高重构青蒿素及其中间体代谢途径（1）青蒿素及其中间体固有代谢途径的转移、重构与工程化（2）全新青蒿素及其中间体合成途径的设计、筛选、组装与程序化 目前主要通过两种模式在不同的底盘细胞中构建青蒿素及其中间体代谢途径。青蒿素及其中间体固有代谢途径的转移、重构与工程化只导入了青蒿素生物合成特异途径中

4、的基因导入了底物供应途径的限速酶基因另外导入一条底物供应途径增加前体供应（1）通过“开源”方式增加前体供应提高工程菌的 FPP 池中底物的总量，从而提高进入青蒿素生物合成途径的底物的绝对总量（2）通过“节流”方式增加前体供应限制或减少底物流向别的代谢流促使相对更多的 FPP 进入青蒿素生物合成特异途径抑制竞争代谢途径下调竞争代谢途径从而限制或减少流入竞争代谢途径中的 FPP 供应3L-色氨酸菌种选育代谢工程人体必需的氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料工业等领域生产成本较高，限制了其应用规模市场需求的加大，色氨酸的生产规模不断扩大，对生产菌株的要求也越来越高基因操作，代谢工程新思路，大大提高了色

5、氨酸的发酵产酸水平代谢流分析代谢流分析（metabolic flux analysis，MFA）是对代谢途径流量进行测定分析的方法。近年来，人们通过代谢工程方法改变细胞内部的代谢流分布，使其生成更多的目的产物。代谢流分析成为代谢工程中用以指导遗传操作的理论基础，是代谢网络分析的基本方法。有研究通过分析大肠杆菌L-色氨酸合成的代谢流，利用各菌株在拟稳态下的代谢流分布图，对L-色氨酸菌种进行选育，优化L-色氨酸的生物合成过程。L-色氨酸合代谢流量分布图的建立1.过表达酮酶基因（tktA）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）使大肠杆菌中心代谢流能更多地进入色氨酸合成的代谢途径构建转酮酶基因（tk

6、tA）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）过表达质粒pEML03增加色氨酸前体物质4-磷酸赤藓糖（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的浓度提高色氨酸产量L-色氨酸合代谢流量分布图的建立2.贮碳因子基因（csrA）的敲除利用Red重组技术敲除贮碳因子基因（csrA），增加色氨酸前体物质PEP的供应量转入pEML03，分批发酵试验，考察基因重组对色氨酸发酵过程的影响。通过测定在拟稳态下主要代谢物浓度的变化速率，得到了原菌株和重组菌株L-色氨酸合成的代谢流量分布图L-色氨酸合代谢流量分布图的建立重组菌株与出发菌株的代谢流分析比较本研究所用菌种为苯丙氨酸和酪氨酸缺陷型，因此代谢途径中不考虑苯丙氨

7、酸和酪氨酸合成支路。结合上述分析，建立代谢网络。分别测定并计算拟稳态时期2628 h的葡萄糖消耗速率、色氨酸生成速率及发酵液中能够检测到的丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和组氨酸的浓度变化速率。实验分析出发菌株和重组菌株色氨酸合成的代谢流分布L-色氨酸菌种选育代谢工程总结12对大肠杆菌中心代谢途径的基因操作，tktA和ppsA的过表达、csrA的敲除，以及二者的叠加，均能有效改变中心代谢途径的流量，并增加L-色氨酸生成的代谢流。tktA和ppsA过表达的影响更为显著，虽然csrA的敲除对各代谢途径影响不大，但可以适当补充因分流而造成的PEP的不足，在质粒pEML03存在的情况下能显著增加L-色氨酸生成的

8、代谢流。4展望请输入您要的内容请输入您要的内容请输入您要的内容请输入您要的内容请输入您要的内容请输入您要的内容药物生物合成的新方向基因工程的高级阶段新的科学领域参考文献1刘万宏,黄玺,张巧卓. 青蒿素生物合成与基因工程研究进展J. 中草药,2013,01:101-107.2潘希武,卢山. 青蒿的萜类代谢及其生物工程J. 云南中医学院学报,2009,04:60-63.3孔建强,王伟,程克棣,朱平. 青蒿素的合成生物学研究进展J. 药学学报,2013,02:193-205.4申彤,徐庆阳,张成林,谢希贤. 大肠杆菌L-色氨酸合成的代谢流分析J. 生物技术通讯,2014,01:49-52.5Shen T, Liu Q, Xie X, et al. Improved production of tr