代谢工程2015(共10页)

1、代谢工程2015第一章节点、柔性节点、强刚性节点、弱刚性节点、依赖型代谢网络、独立型网络、代谢流分析、弹性系数、流量控制(kngzh)系数。1、节点(ji din)：网络分流(fn li)处的代谢产物称为节点。2、柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。3、强刚性节点：是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。4、弱刚性节点：是指介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，

2、且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。（柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象）5、依赖型代谢网络：如果代谢网络中各节点同等重要，即对产物的产量具有相近的影响，则这类代谢网络称为依赖型代谢网络。独立型代谢网络：如果代谢网络的主节点不集中，则可以通过对代谢的修饰影响目的产物的产量，这类网络为独立型网络。6、代谢流分析：代谢流分析是代谢分析的一个重要手段。它假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，通过测定胞外物质浓度，再根据物料平衡计算细胞内的代谢流。（放射性标记、同位素示踪技术）7、弹性系数和流量控制系数是代谢控制分析研究的两个主要指标。弹性系数揭示代谢物浓度变化对反应速率的影响程

3、度。流量控制系数则为单位酶变化量引起的某分支稳态代谢流量的变化，用来衡量某一步酶反应对整个反应体系的控制程度。这两个系数相互关联，可直接或间接测定。代谢工程要解决的主要问题、典型目标及主要应用方向要解决的主要问题：改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质在不同途径中的流量分布。典型目标是修饰初级次级代谢，将碳架物质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物的最大转化率。应用方向：（1）提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；(2) 改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最终产物；(3)对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成

4、的新产物；(4)优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极端环境条件和耐受性等。概述微生物代谢网络理论代谢(dixi)网络理论把细胞的生化反应以网络(wnglu)整体而不是孤立地考虑。细胞代谢的网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又彼此互相协调。各种代谢都不是孤立进行(jnxng)的，而是相互作用、相互转化、相互制约的一套完整、统一、灵敏的调节系统。阐述代谢工程研究方法和技术主要的三大常用手段(1)检测技术 常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶促反应动力学分

5、析方法;测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据这些检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态，并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。(2) 分析技术 在获得大量生化反应基本数据的基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学 工程学的研究方法并结合先进的计算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，以确定代谢改造的思路。这些分析手段包括能准确测定细胞内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组合法以及代谢网络优化技术等。(3) 基因操作技术在代谢工程中，代谢网

6、络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化， 基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提就是外源基因在所有生物物种（包括人体）中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件的开发。论述代谢改造常用三大思路及代谢设计原理代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代

7、谢途径和构建新的代谢途径三种方法。(1)改变代谢途径方法：一是加速限速反应，即增加限速酶的表达量，来提高产物产率。然而限速酶反应的改变可能会给整个代谢网络带来负面影响。二是改变分支代谢途径流向，即提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。(2)扩展代谢途径：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。(3)转移或构建(u jin)新的代谢途径：通过转移代谢途径、构建(u jin)新的代谢途径等方法来实现。代谢(dixi)设

8、计原理一、在现存代谢途径中改变目的产物代谢流增加目的产物代谢流从以下方面入手：1、增加限速酶编码基因的拷贝数2、强化以启动子为主的关键基因的表达系统3、提高目标途径激活因子的合成速率4、灭活目标途径抑制因子的编码基因5、阻断与目标途径相竟争的代谢途径6、改变分支代谢途径流向7、构建代谢旁路大肠杆菌糖代谢未端产物乙酸能抑制菌体的生长，应用代谢工程的方法将枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，构建新的代谢旁路，结果能明显的降低细胞中的乙酸浓度，使乙酸始终处于较低的水平。8、改变能量代谢途径 将血红蛋白基因导入大肠杆菌或链霉菌中，不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率，而且也可以促进

9、蛋白和抗生素的合成。血红蛋白的作用在于在限氧条件下提高了ATP的产生效率。二、在现存途径中改变物流的性质指使手原有途径更换初始底物或中间产物，以达到获得新产物的目的。可以通过以下两种方法：1、利用酶对前体库分子结构的宽容性 如利用酶的相对专一性，投入非理想型初始底物参与代谢转化反应，就可以进而合成细胞原不存在的化合物。2、通过修饰酶分子以拓展底物识别范围修饰酶分子的结构域功能域，以扩大酶分子对底物的识别范围和催化范围。三、在现存途径基础了扩展代谢途径 在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。四、利用已有途径转移或构建新的代谢途径 在明确了已有的生物合成

10、途径、相关基因以及各步反应的分子机制后，通过相似途径的比较，可以利用多基因间的协同作用构建新的代谢途径。1、转移多步途径以构建杂合代谢网络 相关的基因如果以基因簇的形式存在，往往能更便利。2、修补完善细胞内部分支途径，以合成新的代谢产物物流限制作用的克服措施代谢途径存在着固有的限速步骤，它们控制着流经代谢途径的代谢物流，其主要特征表现在：限速步骤的反应速度很低，整个系统的代谢物流取决于催化该反应步骤的酶活性；限速步骤直接受制于该步骤酶活性和酶蛋白(dnbi)合成的调节。调节(tioji)方法：(a) 等量提高(t go)所有酶的量（不能提高转化率）； (b) 提高限速酶的量（鉴别出具有高的流量

11、控制系数的酶比超表达个别酶往往能获得更好的结果）。载流途径、代谢主流的变动性和选择性载流途径：代谢主流流经的代谢途径为主要载流途径，简称载流途径。在代谢工程领域，是指碳流在代谢网络中通过的主要途径，即生产所需产物期间让碳流相对集中流向产物合成的途径。代谢主流的变动性和选择性：微生物的代谢主流处于不断变化之中，其方向、流量甚至代谢主流的载流途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络途径的选择性。这种变动和选择的根据在于微生物细胞的遗传物质，选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。代谢压力外源质粒的导入、重组基因的转录和表达对宿主细胞代谢造成的影响。1、外源质粒可造成的宿

12、主细胞生长速率下降。2、仅32秒瞬间厌氧状态就会造成大肠杆菌副产物的积累和重组蛋白产量下降。3、乙酸的积累造成目标蛋白产量下降和生物量降低4、高CO2造成 TCA（三羧酸循环）途径碳流量的减少，造成乙酸积累和生物量下降上述研究证明了外界环境扰动会带来的代谢流量分布的不同。也指出了可以通过控制碳代谢流操纵生产过程的观点。但目前还没有见到通过调节代谢压力操纵生产的实际应用的报导。第二章松弛时间近似一级反应过程的特征时间。当某反应的松弛时间比系统松弛时间长很多时，认为该反应过程是冻结的。如果一个反应的松弛时间是整个系统的1/3，那么认为该反应是处于拟稳态。通过忽略在系统反应松弛时间之外的反应和代谢途

13、径可显著简化代谢过程。微生物细胞供能反应的类型有哪些糖酵解：末端产物为丙酮酸发酵TCA循环和氧化磷酸化回补途径用于氨基酸合成(hchng)的转氨途径脂类、有机酸和氨基酸的分解代谢来源于HMP或PP途径的氨基酸和核酸(h sun)生物合成的前体物质5-磷酸核糖和4-磷酸赤藓糖是氨基酸和核酸生物合成(hchng)的前体物质EMP途径中的三个代谢物：3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸在高的比生长速率下，PP途径活性增加的原因，举例说明细胞对PP途径生成的NADPH和代谢物需求的增加，尤其是RNA生物合成对5-磷酸核糖需求的增加6-磷酸葡糖脱氢酶受NADPH/NADP+的比值来调节磷酸果

14、糖激酶则是一个复杂的别构酶，称为分析复杂代谢途径的一个中心点。该酶会受到高浓度ATP的抑制，高的ATP浓度会使该酶与底物果糖-6-磷酸的结合曲线从双曲线形变为S型。而柠檬酸就是通过加强ATP的抑制效应来抑制磷酸果糖激酶的活性，从而使糖酵解过程减慢。受调节物2,6-二磷酸果糖的促进。与该物质的结合会导致酶对6-磷酸果糖的亲和力极大增加。因磷酸果糖激酶是糖酵解作用的限速酶，因此，对此酶的调节是调节酵解作用的关键步骤。细菌乙醇代谢途径与酵母乙醇代谢途径的差别第三章原核生物细胞酶合成调节的机制主要分哪几种，并简要(jinyo)说明1.酶的诱导(yudo)负向控制（如乳糖对-半乳糖苷酶）与正向(zhn

15、xin)控制。2.终产物阻遏作用和弱化调节。3.分解代谢物阻遏（如葡萄糖对-半乳糖苷酶的阻遏）。4.转录后的调节。诱导作用是指培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中相应酶的合成速率。诱导的生理作用是可以保证能量与氨基酸不浪费，不把它们用于合成那些暂时无用的酶上，只有在需要时细胞才迅速合成它们。终产物阻遏作用和弱化调节没有阻遏体系，似乎只有弱化作用也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为当有大量外源色氨酸存在时，通过阻遏体系阻止非必须的先导mRNA合成，使合成更加经济。分解代谢物阻遏所谓分解代谢物阻遏是指当细胞内具有一优先利用的营养物（通常是，但并不总是葡萄糖）时，其分解产物对分解利用其它

16、（难利用）营养物质所需的酶系合成起阻遏作用。 转录后的调节翻译水平的调控：（1）mRNA 的稳定性（2）翻译(fny)起始的概率（3）蛋白质合成(hchng)速率微生物细胞酶活性的调节机制有哪些(nxi)，请简要说明。主要有:（1）别构（变构）调节理论（其核心是酶分子构象的改变）（2）酶分子的化学修饰理论（其核心是酶分子结构的改变）（3）其它调节机制别构（变构）效应是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。变构蛋白质是表现变构效应的蛋白（例如阻遏蛋白），具有变构作用的酶称为变构酶。变构酶的反应速度与底物浓度（或

17、变构抑制剂的浓度）的关系曲线呈S型，有协同性；当底物或效应物浓度极低时，酶反应速度的变化极微小，这是因为效应物浓度极低时，不具有协同性，当效应物浓度超过某个水平（阈值）时酶反应速度急剧增大（减小）。即存在着底物或效应物对反应速度发生影响的阈值。这在代谢控制上具有很大的生理意义。乳糖操纵子的诱导原理，实践中，启动乳糖启动子表达为什么可选用IPTG作诱导物？1、组成型表达：在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达，无论表达的水平高或低，它受环境因素的影响较少、或变化很小。 且基因表达产物通常是对生命过程必需的、必不可少的，这类基因通常被称为持家基因（housekeeping gen

18、e）。2、诱导（induction）：在特定的环境信号刺激下，相应基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导 (induction)。3、阻遏（repression）：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 (repression)。4、协调表达：在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，使各表达产物的分子比例适当，从而正常发挥功能。这种现象称为协调表达 (coordinate expressi

19、on)，这种调节称为协调调节 (coordinate regulation)能诱导酶的合成，但又不被分解的分子,称为安慰诱导物（gratuitous inducer）。由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。某些诱导物与自然的-半乳糖苷相似，且不能被酶分解，比如异丙基-D-硫代半乳糖苷，（isopropylthiogalactoside,IPTG）不被细菌分解性质稳定，它的浓度在实验中不会改变。复杂的动力学问题，便于研究。IPTG能在缺乏lacY（乳糖通透酶）基因下而有效地被运送。半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了 水解活性，但硫代

20、半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为-半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。第四章次级(c j)代谢与初级代谢关系存在(cnzi)范围及产物类型不同对产生(chnshng)者自身的重要性不同同微生物生长过程的关系明显不同对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同相关酶的专一性不同某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型次级代谢的特点与生理功能1）次级代谢产物的产生与微生物的生长不呈平行关系。2）次级代谢产物的生物合成以初级代谢产物为前体，并受初级代谢的调节。3） 次级代谢酶系对底物要求的专一性不强4）次级代谢产物种类繁多、结构特殊5）次级代谢酶

21、在细胞中具有特定的位置和结构。次级代谢可维持初级代谢的平衡次级代谢产物是贮藏物质的一种形式使菌体在生存竞争中占优势与细胞的分化有关第五章应激反应系统细菌在动态多变的环境中(温度,pH,压力,氧化,营养,以及各种化学物质刺激等),细菌存在一个整体调控网络可以快速调节大量基因表达来快速适应这种环境变化,这种调控网络被称为stress response系统.stress response systems在细菌中高度相似的,有一些在真核细胞和古菌中也是保守的(如热休克反应).不同菌间,激活stress response 条件不一样细菌紧缩响应当细菌处于一种或数种氨基酸全面匮乏的“氨基酸饥饿”状态时，总

22、之是在营养不良条件下生长时，为了响应这种困难环境，细菌必须迅速地关闭许多生理活动，停止包括各种RNA（特别是rRNA）在内的几乎全部生物化学反应过程，只保持维持生命最低限量的需要。RNA合成速度下降1020倍，使RNA合成水平降到正常状态的510%，mRNA总合成量减少3倍，蛋白质降解速度提高，碳水化合物、脂类合成均明显减少等。这一系列响应称为stringent response或stringent controlppGpp 的生理功能a) 它们是细菌细胞紧缩控制(kngzh)（反应）的信号或称警报素（alarmone）,当细胞处于氨基酸缺乏(quf)时，它们的水平升高。b) ppGpp与RNA聚合酶结合，使后者构型发生改变，从而识别不同(b tn)的启动子，改变基因转录的效率或关闭、或减弱、或增加。在大肠杆菌中，ppGpp抑制6sRNA聚合酶活性，于是rRNA操纵子不能表达抑制rRNA的合成。c) ppGpp与启动子结合，使后者不再与RNA聚合酶结合，导致基因被关闭。d) pp