11种植物提取物对4种病原细菌的抑菌活性筛选

1、11种植物提取物对4种病原细菌的抑菌活性筛选植物源杀菌剂具有选择性高、环境友好、对非靶标生物安全、低毒、低残留 等优点，从植物中寻找抑菌活性物质，是研发新型杀菌剂的热点之一。目前， 中国开发与应用的植物源杀菌剂主要有苦参碱、黄岑苷、小檗碱、丁子香酚、香 芹酚、儿茶素、大蒜素、乙蒜素、大黄素甲醚等。但前述产品多集中于对植物真 菌病害的防治，对植物源杀细菌剂的研究大多侧重于食品污染菌的控制，且大多 数还处于室内筛选阶段。魏希颖等研究发现泡桐花提取液对金黄色葡萄球菌有很 强的抑制作用。叶舟测定了木麻黄(Casuarina equisetifolia Forst)小枝提取 液的抑菌活性，发现对大肠杆菌

2、、金黄色葡萄球菌表现出较强的抑制活性。崔彦 等的研究证明五倍子、丁香、地榆对黄瓜细菌角斑病菌表现出显著的抑制作用， 其中五倍子提取物的活骨I防效可达60%，具有一定的开发潜力。李玉玲发现竹 焦油对甘蓝黑腐病菌、番茄细菌性斑点病菌、茄青枯病菌等多种供试细菌都有不 同程度的抑制活性。为了获得对植物细菌病害有广泛抑菌谱的植物源物质，本研 究选取已报道过的具有广泛抑菌活性的11种植物提取物，对魔芋软腐病菌、猕 猴桃溃疡病菌、核桃黑斑病菌、白菜软腐病菌4种常见的病原细菌进行室内抑菌 活性筛选，旨在为新型植物源杀细菌剂的开发研究提供线索。1材料与方法1.1材料1.1.1 供试菌种魔芋软腐病菌(Erwini

3、a carotovora pv. carotovora)、 猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv. actinidiae )、白菜软腐病菌 (Erwinia carotorora )均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供； 核桃细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv. juglandis )由西北农林 科技大学林学院提供。1.1.2供试植物源物质及试剂大黄提取物（其中大黄素含量为0.30% ）、 博落回提取物（其中血根碱含量为0.57%）、狼毒提取物（其中狼毒素含量为 1.90%）、皂荚提取物（其中皂荚素含量为6.90%）、苦参提取

4、物（其中苦参碱 含量为2.15%）均由山西德威生化有限公司提供。90%的小檗碱、蛇床提取物 （其中蛇床子素的含量为10%）、藜芦生物碱（其中藜芦胺含量为2.30%）、 98%的肉桂酸、98%的丁香酚、98%的柠檬酸铜均由西北农林科技大学无公害 农药研究服务中心提供。72%的农用链霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公 司。丙酮、葡萄糖、琼脂粉、氯化纳、胰蛋白腺、酒精、牛肉膏、酵母粉均购于 陕西天成化玻有限公司。1.2方法1.2.1培养基配制方法室内生测用于细菌性病原菌的培养与保存的固体培 养基（NA）:称取琼脂粉15 g、蛋白腺5 g、牛肉膏3 g，加水至1 L，灭菌锅灭菌待用；用于活化细菌性

5、病原菌菌株的液体培养液（LB）：称取胰蛋白腺10 g、酵母粉5 g、氯化钠3 g， 加水至1 L，灭菌锅灭菌待用。1.2.2药剂配制采用对供试病菌没有抑菌作用的丙酮作为溶剂，将供试植 物源物质溶解。用20%丙酮-水溶液将各植物源提取物或化合物按其有效成分含 量溶解稀释成2 000 pg/mL药液（作为母液备用）。用无菌水将各母液分别依 次2倍稀释最终确定为1 000、500、250、125、62.5 pg/mL 5个浓度梯度 处理，均以浓度为200 pg/mL的72%农用链霉素作药剂对照，采用对供试细菌没有抑菌作用的20%丙酮-水溶液作为空白对照，每个处理重复3次，以减少 误差。1.2.3供试

6、菌种的准备将供试菌种在试验前1 d转接到LB培养液中，置于 28 C恒温摇床箱中活化12 h。用无菌水调配成菌液浓度为1x106 CFU/mL , 以供室内抑菌活性筛选使用。1.2.4琼脂扩散法室内抑菌活性筛选方法 采用琼脂扩散法进行室内抑菌活 性筛选，将溶化的营养琼脂培养基冷却至45-50 1,加入活化好的细菌数量大 于106 CFU/mL的供试菌悬液摇匀（成带菌培养基）。每次取15 mL的带菌培 养基，分别倒入直径为9 cm的玻璃培养皿中，制成带菌平板。待冷却后用直径 为9 mm的打孔器在平板上均匀打3个孔，并用接种针挑出孔中培养基，在每 孔内加入75 pL配好的供试植物源物质，以200

7、pg/mL的农用链霉素作为药 剂对照，并以丙酮作为溶剂对照，每组处理重复3次。置于28 C恒温培养箱中 培养24 h后观察结果，用直尺按十字交叉法测量抑菌圈直径（减去孔径9 mm） 求取平均值，进行比较。1.2.5最低有效抑制浓度（MIC ）的测定方法 采用二倍稀释法测定待测植 物源物质的MIC值，取编号为1 11的试管以及适量的蒸馏水，放入灭菌锅里 灭菌待用。灭菌完成后，取无菌试管，分别往试管内加入2 mL无菌水。将2 mL 浓度为2 000 pg/mL待测药液加入1号试管中，摇匀后，将混合后的药液2 mL 加入2号试管中，依次操作到10号虎管为止，弃掉10号管中的2 mL药液，使 各个试管

8、中的药液体积一样，将11号管设为空白对照，加入同等含量丙酮的水 溶液。每种病菌设3组重复处理。最后将稀释好的细菌数量达104 CFU/mL的 病原菌菌悬液2 mL分别加入1 11号试管中，置于适宜的温度培养箱中培养，待空白对照试管菌液出现浑浊，观察结果，进行比较。结果判断：由于菌液与药液等量混合，相当于将药液二倍稀释，最终待测药液为10个浓度梯度，分别为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、1.8、0.9 pg/mLo结果观察：通过肉眼比对发现试管内液体澄清透明经震荡后仍无沉淀产生， 则此试管对应的药液浓度即为此药剂对待测病菌的MIC值。1.3数据分析利用SPS

9、S 20.0软件对数据进行统计分析。2结果与分析11种植物提取物对4种病原细菌的室内抑菌活性筛选2.1.1魔芋软腐病菌的室内抑菌活性筛选采用琼脂扩散法测定了 11种植 物提取物对魔芋软腐病菌的抑制活性，结果表明，供试11种植物提取物对魔芋 软腐病菌的抑制效果有明显的差异。大黄、狼毒、博落回提取物、小檗碱、肉桂 酸和藜芦生物碱6种植物提取物对魔芋软腐病菌均有不同程度的抑制作用(表 1),皂荚、苦参、蛇床提取物及丁香酚、柠檬酸铜对魔芋软腐病菌则无明显抑 制效果。由表1可看出，博落回提取物对魔芋软腐病菌的抑制作用最强，浓度在 1 000 pg/mL时，抑菌圈直径最高达(19.30.30 ) mm ;

10、其次是大黄、狼毒 提取物，抑菌圈直径分别为(17.30.48 )、( 11.90.26 ) mm，均高于或相 当于对照药剂农用链霉素200 pg/mL的抑菌圈直径(12.60.26 ) mm洞时， 小檗碱、藜芦生物碱的抑菌圈直径也达到了( 10.00.26 )、( 10.10.34 ) mm , 对魔芋软腐病抑制作用较好；肉桂酸仅有微弱抑菌活性，其1 000 ?g/mL处理 抑菌直径仅(0.30.10) mm。2.1.2猕猴桃溃疡病菌的室内抑菌活性筛选 通过对猕猴桃溃疡病菌的室内 活性筛选结果表明(表2),在浓度为1 000 pg/mL时，大黄和狼毒提取物抑菌圈直径分别为(13.30.47 )

11、、( 12.20.32 ) mm，均大于对照药剂农用链霉素浓度在200 pg/mL时的抑菌圈直径(12.00.18 ) mm ;博落回、皂荚、 苦参、蛇床提取物对病原菌抑制作用次之，最大抑菌圈直径在6.7 9.8 mm之 间；柠檬酸铜的最大抑菌圈直径为(0.20.00 ) mm，抑菌作用较弱；小檗碱、 丁香酚、肉桂酸以及藜芦生物碱则无明显抑制效果，故在表2中未列出。2.1.3核桃黑斑病菌的室内抑菌活性筛选从表3结果可看出，蛇床子提取 物对核桃黑斑病菌的抑菌作用最好，在浓度为1 000 g/mL时，抑菌直径达到 (12.70.13) mm，其次是苦参提取物，抑菌圈直径为(10.00.23) mm

12、。皂荚提取物、丁香酚、肉桂酸对核桃黑斑病菌也有一定的抑制作用。大黄、博落 回、狼毒提取物、小檗碱、柠檬酸铜以及藜芦生物碱对核桃黑斑病菌无抑制作用， 在表3中未列出。而药剂对照链霉素在200 ?g/mL时抑菌圈直径达(17.00.58 ) mm。由此表明，这11种植物提取物对核桃黑斑病菌抑制作用不显著。2.1.4白菜软腐病菌的室内抑菌活性筛选试验结果(表4)表明，在11种 供试植物提取物中，仅苦参提取物、丁香酚和肉桂酸对白菜软腐病菌有抑菌作用， 而大黄、博落回、狼毒、蛇床子提取物、小檗碱、柠檬酸铜、藜芦生物碱及皂荚 提取物对白菜软腐病菌无明显抑制作用，在表4的抑菌活性筛选的结果中未列 出；苦参提

13、取物、丁香酚和肉桂酸对白菜软腐菌均有一定的抑制作用但不显著， 其最大的抑菌圈直径均比对照药剂农用链霉素在200 ?g/mL时的抑菌圈直径 小。2.2抑菌活性较好的植物源物质的MIC测定结果5种植物提取物对魔芋软腐病菌的MIC测定结果由表5可知，大黄 和博落回提取物对魔芋软腐病菌的MIC值分别为7.8、15.6 ?g/mL，均显著低 于对照农用链霉素的MIC值31.3 ?g/mL。狼毒提取物、小檗碱和藜芦生物碱的 MIC值分别为125、62.5、250 ?g/mL，表现出一定的抑菌活性，与表1的抑 菌圈试验结果基本一致。综合表1和表5可知，大黄和博落回提取物对魔芋软 腐病菌的抑菌作用最为显著，有

14、进一步研究的潜力。同等含量丙酮的水溶液对魔 芋软腐病菌的MIC值无影响。6种植物提取物对猕猴桃溃疡病菌的MIC测定结果 从表6可知，大 黄提取物对猕猴桃溃疡病菌的MIC值与对照农用链霉素均为3.9 ?g/mL，表明 猕猴桃溃疡病菌对大黄提取物比较敏感。其次苦参和狼毒提取物的MIC值均达 到15.6 ?g/mL，皂荚和博落回提取物分别为31.3、250 ?g/mL，与表3的抑 菌活性筛选结果基本相同。结合表56可看出，大黄、博落回和狼毒提取物对 魔芋软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌均有显著的抑制作用，表现出广谱的抑菌活性。 同等含量丙酮的水溶液对猕猴桃溃疡病菌的MIC值无影响。3种植物提取物对核桃黑斑病

15、菌的MIC测定结果由表7可见，核桃 黑斑病菌对农用链霉素最敏感，其MIC值为7.8 ?g/mL。皂荚、苦参和蛇床子、 提取物的MIC值分别为15.6、31.3、15.6 ?g/mL,也表现出较好的抑菌活性。 同等含量丙酮的水溶液对核桃黑斑病菌的MIC值无影响。3讨论本研究采用琼脂扩散法、二倍稀释法对11种植物提取物对魔芋软腐病菌、 猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃细菌性黑斑病菌4种病原细菌的抑菌活性 进行了研究。结果表明大黄、博落回和狼毒提取物均具有显著抑制植物病原细菌 的活性，有开发为新型植物源杀细菌剂的潜力。其中，大黄提取物对魔芋软腐病 菌和猕猴桃溃疡病菌的抑制效果最为突出；博落回提取物

16、对魔芋软腐病菌、狼毒 提取物对猕猴桃溃疡病菌、蛇床提取物对核桃黑斑病菌的MIC均在20 ?g/mL 以下，与相应的对照药剂农用链霉素的MIC值相当，有显著的抑菌活性。苦参、 蛇床子和皂荚提取物望寸特定病菌有良好的抑制活性，在杀细菌应用上有研究的价 值。狼毒、大黄和博落回提取物在抗细菌作用方面的研究甚少，且多集中于医药、 食品研究。前人的=研究表明，狼毒石油醚提取物的杀烟蚜活性最好；瑞香狼毒 提取物对小菜蛾、枸杞蚜虫有十分显著的毒杀活性。南苹瑶等发现大黄乙醇提取 物对大肠埃希菌ATCC25922的体外抑菌作用明显。Hazni等研究结果显示，大 黄素对金黄色葡萄球菌、溶血溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、 痢疾杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等都有较强的抑制作用；李文娟研究证明瑞香狼 毒(Stellera chamaejasme L.)乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用 最显著，其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度为0.63 mg/mL ;郁建平研究发现盐酸 血根碱具有很强的广谱抑菌作用，对木霉、根霉、黄曲霉、黑曲霉、米曲霉、毛 霉、酵母的最低抑菌浓度均低于40 ?g/mL。杨军辉等