固定化酶技术及应用的研究报告进展

1、-. z.固定化技术研究进展摘要：固定化酶技术作为一门穿插学科技术，在生命科学、生物医学、食品科学、化学化工及环境科学领域得到了广泛应用。新型载体材料的合成是今后固定化酶开展的一个非常重要的研究领域。本文主要介绍了固定化酶的载体，固定化技术以及在不同行业的应用，主要介绍了在污水处理和医疗行业的应用和开展趋势。关键词：固定化载体污水医疗应用酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反响条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多缺乏，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和

2、产物混在一起，反响完毕后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产本钱提高，而且难于连续化生产；并且别离纯化困难，也会导致生产本钱的提高等。固定化酶技术(Immobilized enzyme technology)克制了酶的上述缺乏。酶的固定化是指采用有机或无机固体材料作为载体，将酶包埋起来或束缚、限制于载体的外表和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。1.传统酶固定化技术传统酶的固定化方法可分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4 种。吸附法是指通过载体外表和酶外表间的次级键相互作用而到达酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物

3、理吸附和离子交换吸附。该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良好的稳定性，有利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活泼的一类酶固定化方法，但共价偶联反响容易使酶变性而失活。交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反响，故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反响系统，且常有扩散限制

4、等问题。上述各种固定化酶的方法所表现出的缺乏之处限制了其广泛应用，因此，设计和合成性能优异的新型酶固定化材料，研制开发简便、实用的固定化方法是目前固定化酶研究的重点之一。2.新型载体材料及固定化技术传统酶的固定化方法虽在一定程度上可以增强生物催化剂的稳定性，但增强幅度有待进一步提高，并且在此过程中，生物催化剂酶催化活力通常损失严重。运用当代高新技术设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。因此目前不断地有新的载体和技术引入酶的固定化领域，如：无载体固定化、微波/超声辅助的固定化、微胶囊固定化、电辅助固定化等，且固定化生物催化剂也越来越广泛地应用于医疗、生物医药、环境保护、食品工业

5、、化学工业、能源等领域。2.1 酶固定化过程中的新载体介孔材料孔道的构造和尺寸对酶活力及稳定性有着明显的影响，在适宜的孔道中酶固定化后其活力提高到游离酶的2倍，大孔道有利于固定化与催化过程中酶蛋白和底物、产物的传输，从而能提高酶的固定化和催化效果。目前，大孔道、高比外表积和孔容的新型介孔材料不断被引入酶固定化领域，因为在大孔道、高比外表积、高孔容的介孔材料中酶的负载量大。2.1.2 纳米管碳纳米管是一种新型纳米材料。它是由石墨片层卷曲而成的无缝纳米管。将生物大分子，如氨基酸、蛋白质、酶、DNA 等结合在碳纳米管的外表或端口上，可提高它在水溶液中的溶解度，为实现碳纳米管的各种生物应用奠定了根底。

6、纳米管的外表与酶之间存在强烈的相互作用，从而使得管酶蛋白构造稳定且保存相当的催化活力，并且用其制成电极能够有效实现底物氧化及电子的传递。硅纳米管用于固定化酶时，能够保持酶的活性，并且提高酶的热稳定性及对PH的耐受性。2.1.3 磁性高分子微球磁性高分子微球是由无机磁性纳米粒子与有机高分子通过包埋法、单体聚合法合成的具有磁响应性和微球特性的粒子。通过共聚合和外表改性，磁性高分子微球外表可被赋予多种活性功能基团如-OH、-COOH、-CHO等。无机磁性纳米粒子应用较多的是Fe3O4，单体聚合法主要包括乳液聚合、无皂乳液聚合、微乳液聚合、种子乳液聚合。磁性微球有良好的外表效应和体积效应，如比外表积较

7、大，微球官能团密度较高，选择性吸附能力较强，吸附平衡时间较短等。它的物理化学性质稳定，具备一定的机械强度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，通过外表改性赋予多种活性的功能基团，这些功能基团可以连接生物活性物质。2.2新型固定化技术2.2.1 微波/超声辅助固定化法微波是一种电磁波。微波加热的主要原理是介质材料的极性分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而摩擦生热，从物质部开场，瞬时到达需要的温度。微波加热具有许多传统加热不具备的优点等。超声波是指振动频率大于20 kHz以上的一种纵波，在介质中传播时，使介质发生物理和化学变化，从而产生一系列超声效应，包括热效应、机械效应、

8、空化效应和化学效应。研究认为，超声波对液体化学反响速度和产率的影响主要是由超声波在液体介质中的空化作用引起的。超声可使液体介质中形成微泡，其破裂伴随能量的释放，可以提高许多化学反响的速度。到目前为止，超声波技术对物质提取，高分子降解，酶解反响等都有很好的促进作用。无载体固定化法无载体固定化酶技术是通过将结晶酶、物理共沉淀的酶进展交联形成固定化酶，包括交联酶结晶CLEC、交联酶聚集体CLEA。交联酶聚集体技术是一种将蛋白质先沉淀后交联形成不溶性的、稳定的固定化酶，这种技术是通过根本纯化的高浓度的蛋白质样品的共价交联来实现的。微胶囊固定化法微胶囊是一种采用高分子聚合物或其他成膜材料将物质的微粒或微

9、滴包覆所形成的微小容器，其粒径一般在微米至毫米级围，通常为5400m。将酶用微胶囊包覆后形成的微胶囊固定化酶，由于被催化物质和产物可自由通过囊壁,因而能起到酶催化剂的作用。3.固定化酶的应用 3.1医疗行业的应用3.1.1 抗生素上应用自20世纪70年代初，欧美国家已开场用特殊的合成树脂固定化青霉素酞化酶来生产6 -APA5，但价格昂贵，酶活还较低。中国关于固定化青霉素酞化酶的研究工作起步较晚，还要靠进口价格昂贵的固定化载体或固定化青霉素酞化酶来满足半合成青霉素生产的需要。用于生产酞胺类抗生素中问体青霉素酞化酶在偏碱性环境下，可以催化青霉素G和头抱菌素G水解，制备生产半合成p酞胺类抗生素所需的

10、中问体:6-氨基青霉烷酸(6 -A PA)和7氨基脱乙酞头抱烷酸7(7 -ADCA )。传统上多采用氧化反响酒旨化及扩环重排等化学反响来合成7- ADCA，但其过程存在着步骤多、反响条件要求高、本钱高、三废污染等问题，现在已逐渐被固定化方法所替代。3.1. 2 氨基酸上应用氨基酸是蛋白质构造的根本单位，对维持机体蛋白质的动态平衡有极其重要的意义。自然界的天然蛋白质中存在20余种根本氨基酸，皆为L型，非根本氨基酸多为外消旋体，然而D型和L型对映体的生理作用迥异。氨基酸主要通过发酵法和合成法生产，D-氨基酸一般通过光学拆分得到。D-氨基酰化酶利用其立体专一性反响，从化学合成的底物生产具有光学活性的

11、D -氨基酸现在技术研究了利用基因重组工程技术构建高活性的氨基酞化酶工程菌连续拆分D, L蛋氨酸。氨基酞化酶工程菌经发酵收集高活性的菌体，通过海藻酸钠包埋技术制备固定化酶，连续拆分D,L蛋氨酸，结果比酶活性大于6 000 u/g湿菌体，酶柱比酶活性大于4 000 u/g酶，半衰期20d,可连续拆分24d,拆分率达90%，收率达74.5%左右。随着基因工程药物和固定化技术的开展，人们对D氨基酸的需求日益增加，因此筛选具有高活力D氨基酰化酶的菌株，并且建立起简单快捷生产D氨基酸的方法有着广阔的工业前景。3.1.3 酶制剂上应用脂肪酶不仅能够催化酷的水解反响，而且能在有机溶剂中催化醇和酸的酷合成反响

12、酒旨交换反响、氨解反响驮合成反响等等。现在技术以cM-纤维素为载体固定化脂肪酶的最适制备条件，固定化酶的酶学特性以及操作的稳定性，结果说明本法制备得到的固定化酶酶活力较高，回收率也较高，最适温度，pH都有了提高，稳定性也提高了，酶和载体问的结合力较结实。目前脂肪酶制造油化学品的重要障碍就是脂肪酶价格较高，而固定化酶具有可以回收、重复使用、稳定性高产品质量高等优点，所以脂肪酶的固定化技术可以在药物制备、食品及轻工等方面广泛应用。药物筛选上应用药物筛选就是对可能作为药物的物质进展初步的药理活性的检测和试验，以求发现其药用价值和临床用途，为开展新药提供最初始的依据和资料。直到20世纪70年代中期，动

13、物实验一直是药物筛选的主要方法，但动物实验存在需时长、劳动强度大、操作技术要求高、受试样品需要量大等缺点。现代科技的开展为高效率的筛选药物提供了技术条件，高通量药物筛选技术 (HTS)就是将多种技术方法有机结合而形成的一种新的技术体系。用于药物筛选的膜蛋白微阵列，由于类脂环境影响膜蛋白的功能难以很好发挥，使微阵列制作有困难。最近微阵列技术取得了突破性进展，解决了膜和蛋白的固定化问题，创造了一种机械上稳定又允许单个分了在固定化膜移动的系统，这种水平方向流动性是生物膜的特性之一。3.1.5 手性药物上应用手性药物的临床意义已引起了人们的注意，并成为国际开发热点，世界正在开发的1 200种新药种有三

14、分之一是手性药物，同时手性药物又是药品开发中的难点，往往是一种对映体具有很大的药用价值，而另一对映体没有药效，甚至对人体有毒害作用。如何从对映异构体中别离出有效成分或合成有效成分是目前面临的一大课题。手性药物相互作用的研究也应用了固定化的方法。如应用亲合色谱技术时，可以在色谱柱上固定化HAS15或AGP16来研究手性药物发生在分布环节的相互作用，就是在流动相中添加并用药物来考察并用药物与对映体在分布环节有无相互作用。3.2食品行业固定化酶可应用于食品检测。固定化酶技术的开展使生物传感器也得到相当大的开展，它不仅使食品成分的高选择性、快速、低本钱分析测定成为可能，而且生物传感器技术的持续开展将很

15、快实现食品生产的在线质量控制，降低食品生产本钱，并且可以保证平安可靠及高质量的食品生产。3.3生物传感器方面在医学领域，生物传感器因快速、灵敏、专一、响应快等优点发挥着越来越重要的作用。目前，在检测多种细菌、病毒及其毒素等多个方面生物传感器已有较广泛应用。比方高精度血糖分析仪是采用固定化酶的生物传感分析仪，其分析精度可以到达0.5%-2%，比家用保健类生物传感器几乎高一个数量级，比目前医用生化分析仪的精度也高2%-3%，这在血糖分析领域是非常重要的。酶电极现已用于测定各种糖类、抗生素、氨基酸、有机酸、脂肪、醇类、胺类以及尿素、尿酸等的含量。3.4固定化细胞技术在废水处理中的应用研究处理氨、氮废

16、水微生物去除氨氮需经过好氧硝化、厌氧缺氧反硝化两个阶段。硝化菌、脱氮菌的增殖速度慢，要想提高去除率，必须要较长的停留时间和较高的细菌浓度，采用固定化细胞技术可做到这点。固定化细胞技术在处理氨氮废水中的主要优势在于可通过高浓度的固定细胞，提高硝化和反硝化速度，同时还可以使在反硝化过程低温时易失活的反硝化菌保持较高的活性。难降解有机废水含酚废水的处理普遍采用活性污泥法，但此法存在污泥产率较高，易产生污泥流失，处理效率低等缺点。固定化细胞对废水中酚类等有毒物质的降解能力远大于游离态细胞。用海藻酸钠包埋对酚具有高效降解作用的小球藻细胞和紫色非硫光合细菌混合菌株，在好氧条件下处理含酚废水，可以明显提高除

17、酚效率，缩短废水停留时间，其共生体系对温度、pH值适应围广，对焦化厂工业废水处理24h，去除率为95以上。含芳香烃废水利用固定化混合菌群可降解芳香烃废水。固定化细胞能利用这些物质进展生长并使之完全降解，例如酚、奈和菲均能被彻底降解。与游离细胞相比，固定化细胞表现出生长稳定，降解能力强的优点。据报道用海藻酸钙凝胶包埋固定化PinelohactersP细胞进展降解吡啶的研究，结果说明：与游离细胞相比，固定化细胞的比降解速率和对吡啶毒性的承受能力并没有提高，但由于固定化细胞具有较高的生物浓度，所以其体积降解速率较高，而且可以重复利用，因此利用固定化细胞降解吡啶是可行的。处理重金属废水由于微生物经固定

18、化后，其稳定性增加，抗生物毒性物质的能力也大大增加，因此，可以被广泛地用于各种有机废水中重金属离子的去除。GeoffeyW等将小球藻固定在藻阮酸盐中，用来聚集Co，Zn，Mn等金属，在5h62的Co，40的Mn，54的Zn被吸附；与之相比，在一样的条件下，悬浮细胞的吸附量要小得多。吴乾蓄等利用聚丙烯酸胺固定化酵母菌细胞去除电镀废水中的Cd2+，在pH=9，Cd2+的质量浓度为1400mgL时，反响lh，Cd2+的去除率98.9；采用未固定化细胞则去除率为37.6。分别用0.lmolL的HCI和0.lmolL的EDTA解吸，Cd2+的回收率为88.5和87.6。在环境监测方面，固定化酶也可以用于

19、测定有毒物质含量以进展环境监测。在废水处理中，固定化酶也越来越受科学家的关注。在水环境污染日益严重的今天，固定化酶的污水处理技术有着广阔的研究潜力和应用前景。4.展望近几年来，酶的固定化技术取得了长足的进步，并成为生物化学研究领域的重点和热点。研究者不断对传统固定化技术进展改良，并开发新的固定化方法，一定程度上改善了一些酶的性能，包括稳定性、催化活力、立体选择性和回收再利用性能，他们用实践证明了酶的固定化仍然是最好的改善酶的催化性能的手段。酶固定化技术已在食品工业、精细化学品工业、医药，尤其是手性化合物等行业得到广泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展。用酶技术生产化工产品，条件温和，无三废产生，随着人类对环保的日益关注，酶的固定化及应用研究已得到长足进展。然而，固定化酶研究具有的高新技术特征与根底理论意义，仍使其处于国际学科前沿，具有很大的研究开展空间。设计和开发新的合成载体材料，利用和改性质优价廉的天然高分子载体材料，探索和研究新的固定化技术将是这一领域的研究热点。而固