生物芯片技术及其应用ppt课件

1、生物芯片技术及其应用南京医科大学第一附属医院临床检验中心 童明庆.1.What is a microarrayMicroarray 或 Biochip （生物芯片）是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的基片表面固定大量的分子识别探针，或构建微分析单元和系统，实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的筛选或检测。A microarray is an ordered array of microscopic elements on a planar substrate that allows the specific binding of genes or gene

2、 products.1.What is a microarrayFour distinct characteristics of microarray :Microscopic target elements or spots;Planar substrates;Rows and columns of elements;Specific binding between microarray target element on the substrate and probe molecules in solution.1.What is a microarrayWhich is the prob

3、e?and which is the target?There are some differences between China and United States of America.In U.S.A. the probe are usually in solution.In China the probe is a reagent to detect target from sample.Biochips的主要类别 蛋白芯片 Protein chips(protein microarray)： 肽芯片，蛋白芯片 基因芯片 Gene chips（Gene microarray）： 靶D

4、NA芯片，多探针芯片 芯片实验室Laboratory-on-a-chip or Microfluidics-based chip .2.Microarray manufacturingThe three main manufacturing methods:Contact printing:uses direct contact between the printing implement or the sample contained in the implement and the microarray substrate;Noncontact printing:on-the-fly pr

5、inting including ink-jet tech.,microsolenoid tech.,and thermal bubble jet dispenser;Semiconductor tech: photolithographic masks and micromirrors.Microscopic elements:Semiconductor tech produce 1530m features Printed spot size is 50350 m Tissue spot is 200600 m Macroarrays contain sample spot sizes o

6、f about 300 microns or larger microarray are typically less than 200 microns in diameter .Gene chips的制备 在片原位光刻合成 O d NTP- 5-光敏保护基因光照O dNTP-OH + dNTP -5-保护基因.在片原位喷印合成.Gene chips的制备cDNA点样法醛基修饰玻片 Silanized slide（与DNA上氨基反应） Silane slide氨基修饰玻片 Silylated slide（UV照射与DNA交联） Polylysine slide玻片氨基化举例：.Nytran尼龍

7、膜点样前变性 變性的終濃度10.4N NaOH/10mM EDTA， 變性的擴增産物被點樣到Nytran尼龍膜上， 用120mj/cm2UV交聯固定(Stratalinker 1800, Stratagene)点样后变性 PCR擴增産物被點入(或布陣)至Nytran尼龍膜 上之後,在0.4N NaOH/3M NaCl中浸濕5分鐘變 性DNA,隨後放在用6SSC浸濕5分鐘中和，再 用120mj/cm2UV交聯固定。.我們有世界第一部量產的點樣機及相關的配套生產線.核酸的杂交.常用的双色荧光标记试剂有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。它们在反转录过程中在DNA中的结合性好，激发和发射谱的间距大，

8、以及光量子产率高。亦可标记酶和生物素。核酸的杂交.基因芯片实验程序.基因芯片实验程序.Gene chips的应用 病原体的检出 肿瘤相关基因表达谱 位点突变 遗传性疾病 测序 耐药基因检测 疾病的分子分型 HLA分型.pPTATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC 基因芯片的测序原理图ATACGTTA.蛋白芯片的原理1.将抗原或抗体交联（UV）或吸附在膜上.2.

9、 抗体或抗抗体标记示踪酶：HRPO、AKP胶体金荧光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻胆蛋白等.POTOMAC 點抗原測抗體3.检测标本中的抗体或抗原.POTOMAC 點抗原測抗體.POTOMAC 點抗體測抗體捕获法.POTOMAC 點抗體測抗原.POTOMAC 滲濾式蛋白芯片的設計.將應用物品先準備好。检测实例.在晶片盒視窗內滴加3滴試劑A，必要時用手輕晃晶片，使膜表面完全浸濕。.待完全滲入後，室溫放置1分鐘，加待檢血清100l。.待血清完全滲入後，再滴加6滴試劑B。.待試劑B完全滲入後，滴加10滴試劑C。.待試劑C完全滲入後，最後滴加6滴試劑D。.反應完畢後0.5小時內，將晶片放

10、入晶片閱讀系統進行閱讀分析。.大淵的PBT-X2-02型生物芯片識別儀器組成。.Protein chip的应用 微生物感染病原体抗原、抗体的检测自身抗体的检测 特定蛋白的检测 HLA分型 过敏原检测 肿瘤标志的检出.大渊结核菌多种抗原的 抗体检测蛋白芯片系统特异性抗原：LAM、16KDa和38KDa蛋白LAM：脂阿拉伯甘露糖，其它分枝杆菌不具备或其含量甚低；38KDa蛋白：较牛分枝杆菌高10倍以上；16KDa蛋白：存在于结核分枝杆菌复合群(人型、牛型、非洲型)中，其它分枝杆菌（MOTT）不存在。其综合檢出率可以達到93%.结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的脂

11、阿拉伯甘露糖（LAM）是细胞壁重要组成成分。结核菌的LAM含量比其他分枝杆菌的含量高许多，因此许多研究都认为检测病人血清中的抗LAM抗体是诊断结核病的重要标志之一。LAM要分布于细胞壁表面，组成成份为碳水化合物。主要生物学活性 1) 抗原性 2)抑制T淋巴细胞增殖 3)破坏巨噬细胞的干扰素活化 4)清除有毒的自由基 5)抑制蛋白激酶等的活性 目前，LAM的主要用途是将其作为主要的包被或者点样抗原，以检测结核患者血清中的相应抗体，用于结核病的诊断。 结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露糖（以下简称LAM） .结核分枝杆菌MPT63抗原（16KDa）结核菌MPT63主要存在于培养滤液中，分子量达16kDa，其

12、基因为MPT63，表达159氨基酸（aa）的蛋白质，29aa为信号肽，130aa为成熟蛋白。MPT63可在感染结核菌的豚鼠诱发体液免疫。MPT63基因仅发现于结核菌复合群（M tuberculosis complex, MTC）。MPT63与常见的鸟分枝杆菌（M avium）的蛋白没有血清交叉反应。 MPT63抗原的种特异性：非MTC分枝杆菌缺乏MPT63，表明MPT63是一个MTC特异性抗原。证据有二：抗MPT63抗体与纯化的MPT63，结核菌培养滤液，牛分枝杆菌PPD反应，而不与鸟分枝杆菌PPD反应。另一方面，采用竞争性ELISA，MPT63与抗MPT63的抗体的反应可被牛分枝杆菌PPD显

13、著抑制，而不被鸟分枝杆菌PPD和BSA（无关蛋白）抑制，因此，MPT63没有环境中常见的分枝杆菌抗原表位，其可作为非常有潜力的免疫诊断用抗原。 .结核分枝杆菌的38kDa蛋白 它有不同的名称，在美、日被称为抗原5（Antigen 5）,挪威将其称之为抗原78（Antigen 78）。Coates等人利用免疫电泳技术测得其分子量为38kDa，故称之为38kDa蛋白38kDa 蛋白为脂蛋白，存在于细胞外 ，含25%碳水化合物，是从细胞分泌的，理论分子量是为38200Da（含信号肽），其与细胞膜或者菌体表面的脂肪结构相连 。 38kDa的反应性：交叉免疫电泳技术（crossed immunoelel

14、trephoresis,CIE）证实结核菌和卡介苗均产生38kDa蛋白，但前者的浓度显著较后者高。分枝杆菌中只在结核菌和牛分枝杆菌（M boris）发现38kDa蛋白，而且结核菌的反应强度较牛分枝杆菌强10倍 。抗-BCG多价抗体也能与38kDa蛋白反应 ，但BCG表达38-kDa蛋白的量很低 。结核分枝杆菌38kd抗原特异性100%，与正常健康人、MOTT感染和麻风分枝杆菌感染无交叉。 .TB蛋白芯片点阵排布识别色点质控点LAM16KDa38KDaH2O1342441122331234.大渊结核芯片系统与DIGFA试剂（上海奥普）检测的总符合率两法检测结核病人和对照组共1285份标本，均阳性

15、326例，均阴性769例，相符总数为1095例。总符合率为85.21%。 武汉钢铁公司总医院、哈尔滨市胸科医院检验科、海南省农垦总局医院、 江苏省人民医院检验中心 （组长单位） .检测抗结核分支杆菌LAM、16和38kD抗原的抗体意义： 鉴别痰涂片阳性者是否属于结核杆菌感染。 提高痰涂片阴性患者的检出率。 肺外结核的检测。 痰涂阴性者的早期诊断。 可作为判断对治疗是否有效的指标。 .大淵心肌梗塞AMI檢測芯片 肌紅蛋白（Myoglobin）是早期診斷最重要的指標1-2小時值升高 4-8小時達到高峰 20-36小時回到正常肌酸激酶同工酶（CK-MB）是診斷AMI最信賴的心肌酶3-8小時值升高 8

16、-24小時達到高峰 3天回到正常肌鈣蛋白I（Troponin I）是診斷心肌損傷最主要的指標4-8小時值升高 12-16小時達到高峰 5-10天回到正常高敏C反應蛋白（hs-CRP）4-8小時值升高 12-16小時達到高峰 5-10天回到正常.大渊蛋白芯片(AMI)对照检测江苏省人民医院临床检验中心上海瑞金医院检验科 湖北省人民医院检验科 项 目 对照试剂 和仪器 例数 一致性相关 系数rc分析CK-MB罗氏ECL2010 5240.852MBBayer公司ACS180plus 5240.915cTnIBayer公司ACS180plus 5240.915hs-CRP贝克曼 Immage5240

17、.89.大渊STD芯片检测系统本晶片含有UU第一群（含1，3，6，14等四個血清型）和第二群（含2，4，5，7，8，9，10，11，12，13等十個血清型）多種抗原，對兩群十四個血清型都能檢出。本晶片含有CT的沙眼生物变种（DK型）和性病淋巴肉芽肿 （ LGV）生物变种可检出UU/CT感染的85以上。泌尿道感染中UU/CT感染占1/3。.大渊STD芯片对比检测结果1.江苏省人民医院（组长医院）， 2.安徽医学院附属医院， 3.南京皮肤病研究所， 4.武汉市华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科 项目 试 剂例数敏感性(%)特异性(%)CT英国立明95588.180.7UU法国梅里埃95586

18、.181.2.大渊TORCH生物芯片大渊TORCH芯片（IgM和IgG） ：检测：弓形体、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒（、）的抗体用于优生优育，孕前和孕早期检测IgM抗体阳性提示现症感染，IgG抗体阳性提示有免疫力。.TORCH检查的临床意义约有30%-46%其弓形体可通过胎盘传给胎儿，直接影响胎儿的发育，导致畸形，甚至死亡。也可使孕妇流产，早产，死产或增加妊娠并发症。孕妇感染风疹病毒后，胎儿出生后多患有白内障等眼疾、耳聋、心血管系统缺损、精神运动性障碍、紫癜等症状，重者可发生死亡和流产。 .TORCH检查的临床意义胎儿CMV感染后严重者则引起流产、死产，轻则造成出生体重偏低或畸形。婴儿

19、先天性感染常带有明显的遗留损害危险，特别是对中枢神经系统影响较多。新生儿感染后死亡率高，存活者也大都发生智力降低，神经性运动障碍等。成人感染HSV的临床表现往往是局部的，新生儿由于免疫力底下，往往是全身散播性的，其病情较重，病死率高，幸存者往往有终身残疾。 .幽门螺旋杆菌（HP）IgG抗体蛋白芯片 大渊Hp抗体芯片检测：细胞毒素相关蛋白A(CagA) 、尿素酶(Ure)和热休克蛋白（HSP）临床意义：根据HP菌株有无细胞毒素相关蛋白A(CagA)蛋白表达将其分为两型：型是高毒力株，含CagA基因，表达CagA蛋白；这类菌株与胃、十二指肠溃疡及诱发癌变密切相关。几乎所有的野生型HP都产生尿素酶(Ure)，Urc抗体的产生是Hp感染的标志。 HSP是一种应激蛋白， HP与HSP检测结果同为阳性，表示HP正在发挥致病作用，需要及时治疗。另外，研究发现HSP60与胃癌的发生有密切的关连。 .大渊自身抗体生物芯片大渊自身抗体芯片：检测：dsDNA,Histone,SSA/Ro,SSB/La,Sm,RNP,Jo-1,Scl-70,Rib-P的自身抗体用于自身免疫病的诊断检查：系统性红斑狼疮、药物性狼疮、混合性结缔组织病、类风湿性关节炎、系统性硬化症、多发性肌炎、干