Western-blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程

1、精选优质文档倾情为你奉上精选优质文档倾情为你奉上专心专注专业专心专注专业精选优质文档倾情为你奉上专心专注专业Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程 (碧云天试剂盒)一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cy

2、toplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。二、注

3、意事项需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4进行。本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(/)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。三、使用说明1.准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF

4、，使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍）2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%处理5min）处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心（1400 r/min 5min）收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。3. 对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。4. 每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A

5、。(对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)5. 最高速剧烈涡旋震荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长震荡时间。)（时间可稍长，保证细胞破碎）6. 冰浴10-15分钟。7. 加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。最高速剧烈Vortex 5秒，冰浴1分钟。8. 最高速剧烈Vortex 5秒，4 12,000-16,000g离心5分钟。9. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。)10. 对于沉淀，完全吸尽残余的上

6、清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)11. 最高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒，共30分钟。12. 4 12,000-16,000g离心10分钟。13. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70冻存。14. 对于新鲜组织：A. 把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为

7、1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4进行。B. 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。C. 4 1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)D. 对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14C中抽提得到的细胞浆蛋白合并。第二部分蛋白定量-BC

8、A 法(南京建成试剂盒)一、实验仪器： 试管、微量移液器、旋涡混匀器、37水浴箱（气浴箱）、可见分光光度计（562nm） 二、适用范围： 本试剂盒可测各种动物血清（浆）、组织、培养细胞、细胞培养上清及植物等样本中的蛋白含量。三、试剂组成及配制试剂一：粉剂2支、稀释液12.5 ml 2瓶试剂一应用液的配制：取试剂一粉剂1支与试剂一稀释液1瓶混匀，溶解完全后4度待用。试剂二：250l 2支工作液的配制：按试剂一应用液：试剂二=50:1的比例配制，混匀后待用，用多少配多少。试剂三：终止剂储备液20ml 1瓶终止剂应用液：取终止剂储备液用双蒸水5倍稀释后备用，4度冷藏试剂四：563 ug/ml 蛋白标

9、准液0.2ml 1支，4度保存1个月（可分装-20冷冻）四、操作步骤： 1、样本前处理： 、动物组织样本：准确称取组织重量，按重量（g）：体积(ml)=1:9 的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500 转/分，离心 10 分钟，取上清液，待测。 、植物组织样本：准确称取组织重量，按重量（g）：体积(ml)=1:9 的比例，加入 9 倍体积的匀浆介质，冰水浴条件下机械匀浆，3500 转/分，离心 10 分钟，取上清液，待测。 、血清（浆）样本：按血清（浆）生理盐水=149的比例稀释，待测。 、其它液体样本：按比例稀释，测定范围为 202000g/ml，（不同的样本稀释度不一

10、样），请在批量测试前先做 12 个样本的预实验。 2、操作表：空白管标准管测定管双蒸水（l）2000563g/ml 标准品（l）0200待测样本（l）0020工作液（l）250250250漩涡混匀，37孵育 30 分钟终止剂应用液（l）750750750漩涡混匀，静置 5 分钟，562nm 波长，水调零，0.5cm 光径测各管 OD 值五、计算公式： 六、测定原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，562nm处有最大吸收峰，依据吸光度与浓度成比例，通过测吸光度即可计算待测蛋白的浓度。七、检测范围检测浓度下限达到20g/ml，最小检测蛋白量达到0.5g，

11、在202000g/ml浓度范围内有良好的线性关系。标准曲线范围：标准品浓度（g/ml）绝对OD值0250000.499第三部分Western blot相关试剂配制A30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37水浴助溶，定容至100mL。0.45m滤器过滤，棕色瓶4避光保存。B10%十二烷基硫酸钠（SDS）：SDS，10g；H2O，80mL。68加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。C10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。避光，4保存。（42周）D分离胶缓冲液（1.5MT

12、ris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4保存。E浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4保存。F电泳缓冲液（10）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。调节pH至8.3，定容至1L，4保存（用时稀释为1）。G5SDSloadingBuffer（5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；溴酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5

13、mL；加去离子水定容至5mL。充分混匀，分装成500L/份，室温保存。使用前每份加入25L-巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。H考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇，室温保存I考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。室温保存。J考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存K膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；加H2O 600mL充分溶解，加200mL甲醇

14、，混匀，定容至1L，室温保存。LTBS缓冲液：NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O搅拌溶解，定容至1L，4保存。MTBST缓冲液：NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O搅拌溶解，加入0.5 ml Tween 20后充分混匀，去离子水定容至1L，4保存。N1M Tis-HCL(pH 8.0)：Tris 121.1g 置于1L烧杯，加入约800ml去离子水，充分搅拌，加入浓HCL约42ml ，定容至1L，高压灭菌，室温保存。第四部分Western blot电泳、转膜及显色过程1、清洗将玻璃板洗净，

15、用ddH2O冲洗，然后晾干。封板时保证支架与底座胶条契合，固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手，固定即可，不要用力过大以免压碎玻璃。封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。2、制胶SDS分离胶配方表（12% Gel）各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)10 ml15 ml20 mlH2O3.34.96.630%Acrylamide4.06.08.01.5MTris-Hcl (pH8.8)2.53.85.010% SDS0.10.150.210%过硫酸铵（AP）0.10.150.2TEMED0.0040.0060.008SDS浓缩胶（5% Acrylamide）配方表各种组分

16、名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)4 ml5 ml6 mlH2O2.73.44.130%Acrylamide0.670.831.01.0MTris-Hcl (pH6.8)0.50.630.7510% SDS0.040.050.0610%过硫酸铵（AP）0.040.050.06TEMED0.0040.0050.0063、封胶 = 1 * GB3 按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否

17、则胶会被冲变型。 = 2 * GB3 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（至少等30-40min）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。4、拔梳子灌好浓缩胶，约40-60min凝胶后均匀用力拔除梳子，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。5、上样 = 1 * GB3 测完蛋白浓度后，计算含20

18、-40g蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5SDS上样缓冲液至终浓度为1。将加入loading buffer的蛋白样品放沸水中煮5-10分钟，高速离心30s即可上样。上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限度可加30l体积。 = 2 * GB3 加足够的电泳液后开始准备上样，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，外侧漠过底部。所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1loading buffer上样。非预染蛋白Maker准备：1M DTT 2l与5loading buffer 20l混合成稀释液22l,然后再加入protein MW maker（LOW）

19、5l、灭菌蒸馏水73l,混合成蛋白Maker,混合均匀后，煮沸处理5min，分装-20保存，取5l进行10%-15%凝胶电泳。6、电泳先稳流30mA电泳至上下胶分界时改稳流45mA。当loading buffer泳动到胶下缘时结束。电泳时间较长时，应用冰块放电泳槽两边防止溶胶。7、转膜 = 1 * GB3 剥胶：轻启玻璃板，将胶卸下，切除浓缩胶及无用胶，右上切角标记，在冷的电转液中平衡20-60min。 = 2 * GB3 材料准备：转一张膜需要2张滤纸（伯乐专用滤纸）和1张0.45um PVDF膜，切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。

20、用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。 = 3 * GB3 处理：将与胶同样大小的滤纸放在转移液中浸泡片刻，PVDF膜需浸泡甲醇1-2min，再孵育于冰的电转液中5min。 = 4 * GB3 电转仪转膜：A、打开保护罩，按照如下准备凝胶三明治：B、从底部铂金正极开始放置：预湿-滤纸预湿-膜已平衡的胶预湿-滤纸注意：每层之间赶走气泡C、连接顶部不锈钢阴极，盖上保护罩D、不同蛋白需要不同优化的条件：参考范围：小胶 10V 30min 或者15V 15min大胶 2

21、5V 30min 或者15V 60min注意：当前不要超过25V，且大胶不要超过3mA/cm2、小胶不要超过5.5 mA/cm2E、关闭电源，拔掉电极，移除胶注：为了防止溶胶，可将转移缓冲液提前放4冰箱预冷过夜 = 5 * GB3 膜上蛋白检测：丽春红2%的丽春红储备液（10）：0.4g丽春红、6g三氯乙酸、6g磺基水杨酸溶于20ml。丽春红染色工作液：2%的丽春红储备液1:10稀释，即加9倍的ddH2O染色方法：将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜直至水变清无色，marker条带处用铅笔做好标记。PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。8、膜的封闭膜用TBST洗完后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。配制5%脱脂奶粉或BSA溶液：每100ml TBST中加入5g脱脂奶粉或BSA，混匀后过滤，如不过滤会导致膜污染上细微黑颗粒。9、一抗的孵育一抗的准备：将一抗按适当的比例用抗体稀释液稀释。孵育buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释一抗。一般参考推荐的稀释倍数1:100-1:3000，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带