电镜超薄切片

1、透射电子显微镜生物制品制备技术 1234冷冻蚀刻法超薄切片5冷冻蚀刻法 冷冻割断术6细胞化学法7免疫组织化学技术 免疫电镜法8电镜放射自显影术 放射自显影技术9扫描电镜技术被吞噬的红细胞10现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、细胞化学法、免疫电镜法、放射自显影技术、X线微区分析技术等。 111、 超薄切片样品的制备（1） 取材 基本要求是在活体情况下进行取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则）1） 快速：1分钟之内投入固定液。2） 块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。3）

2、 部位准4） 损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。5） 低温：0-4oC12取材的方法1）动物材料： 对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。13胚胎干细胞的研究142）培养细胞： 生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。153）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定

3、液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定处理后再离心成团，在50oC中弃去上清液，加入适量的经50oC预温的2%的琼浆，使团悬浮，将悬浮团和琼脂液一同在薄片上展层，固定后切成1mm3的小块。16（2）固定 固定的目地是把细胞在活体状态时的结构尽可能完整的保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或外界微生物的侵入而产生腐败，致细胞的超微结构破坏。171）固定液的作用A阻止细胞自溶。B 稳定细胞物质成分。C 在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链，提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。D能提供一定的电子反差 18 理想的固定剂，应具备以下条件：能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种

4、成分；能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；可保存酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。192）影响固定效果的因素固定液的酸碱度(pH值)固定液的pH值渗透压缓冲液的类型固定的温度和时间当前采用的是在04下固定1 4小时。203）常用的几种固定剂A 四氧化锇（osmium tetroxide,OsO4）亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.5-1g包装，淡黄色晶体。具有挥发性和毒性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有刺激作用，在通风橱内径相配制。21优点对蛋白质和脂类固定较好。对作为细胞骨架的磷

5、酸脂蛋白的作用好，对核蛋白保护作用很好，因为在有机体内核酸和碳水化合物与蛋白制成复合的形式，因此锇酸几乎和所有的细胞成分结合。分子密度高，产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。缺点不能固定糖元和核酸，对微管固定较差。扩散慢，穿透能力差。具有挥发性和粘膜毒性。不适于进行细胞化学工作。22B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2）纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质，影响固定。 优点 (1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间，适用于进行超微细胞化学研究。 23

6、C 甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对酶的活性保存好。 24252）固定的方法A 单固定法：对单细胞或固定液易于浸透的组织，一般单独用1-2%四氧化锇固定液固定1-2小时可达到固定的目地。B 双固定法：戊二醛（2.5% 4oC 2h）-锇酸（1% 4oC 2h）。C 原位固定和灌注固定：将动物麻醉、解剖进行原位固定。灌注固定：通过血液循环将醛类的固定液灌流到所需组织中。神经组织、视网膜、肾脏。26附 几种常见固定剂的配制 固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,对含水较多的组织可用PH值8.0，细菌、病毒可用PH值在7.0以下

7、。0. 2mol/L磷酸缓冲液的配制 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6g 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 29g 重蒸水 加到500ml 调PH到7.4270.2mol/L二甲坤酸盐酸缓冲液重蒸水 25ml二甲坤酸钠（Na(CH3)2AsO2.3H2O） 2.14g0. 1mol/L盐酸 8ml重蒸水 加至50ml调PH到7.4 28B 固定液的配制锇酸固定液的配制2%的锇酸固定液的配制：清洗烘干器皿-1G锇酸+50ml双蒸水（棕色瓶）数日可用。0.1mol/L磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的1%锇酸固定液。 2%的锇酸缓冲液 10ml 0.2mol/L缓冲液 10m

8、l 调节PH应为7.3-7.429戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml） 0.4 1 1.6重蒸水（ml） 4.6 4 3.40.2ml/L缓冲液（ml） 5 5 5戊二醛最终浓度 1 2.5 4调节固定液PH值到7.3-7.430（3） 脱水1）清洗:固定后均用和固定液相同的缓冲液冲洗3次，每次15分钟2） 脱水：常用的脱水剂为乙醇和丙酮。乙醇引起组织中脂类物质抽提较丙酮少，且不会使组织变硬、变脆，故为常用脱水剂，然乙醇不容易和用于包埋剂的环氧树脂相混溶，因此在进入包埋剂之前常用中间剂环氧丙烷置换。31脱水程序如下表浓度50%70%90%100%时间10-1510-1510-153次（每次1

9、0-15）温度4oC4oC转室温室温32经验：脱水剂临时配制。浓度梯度上升。脱水时间和浓度。脱水时的连续性。脱水剂的选择。33（4）浸透：其目的是通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂取代脱水剂，使其渗透到组织中去。 脱水和包埋剂的比例2:11:2纯包埋剂时间1-2h2-3h2h温度室温室温37oC温箱34经验：浸透时间。浸透温度。35（5） 包埋：目的:包埋的目的是让包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片的各种力的作用，有利于切薄片。包埋剂的性质:粘度适中，有良好的切割性能。能耐受电子束的轰击，高温不易升华、不变形。透明度好。对人无害。36包埋剂的

10、种类环氧树脂类：目前国内使用较多的环氧树脂有进口的Epon 812和国产的618。原理:环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。37这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。38低粘度包埋剂(Spurr) 为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应

11、用已日趋广泛。这是一种低粘度的树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。 39水溶性包埋剂： 是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。 原理:水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。 包埋剂:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(简称GMA)、聚乙二醇、Aquon等 40所加的固化剂，有十二烯基虎铂酸酐（DDSA）和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐（MNA）,增韧剂为邻苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速剂为2,4,6,一三苯酚（DMP3

12、0）。411） 环氧树脂的性能和配制：618树脂 5ml十二烯基丁二酸酐 DSA（固化剂） 5ml苯二甲酸二丁酯 DBP（增塑剂） 0.3ml2,4.6三苯酚 称DMP30（加速剂） 0.1ml60oC烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌10分钟，至37oC温箱中使气泡逸出。 42Epon812的配制A液：Epon812 62ml DDSA(固化剂) 100mlB液：Epon812 100ml MNA(固化剂) 89mlA液和B液分别配制，使用时用不同比例将二者混合后再加1.5%DMP-30(加速剂)即可。A液和B液的比例：冬季2

13、：8。夏季1：9。B液可以增加包埋块的硬度。431） 包埋的方法44常规包埋 将浸透在包埋剂的组织块，转移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋剂。 把写好标本块编号的小纸条卷成环状，放入囊中，插入包埋剂中。 不加盖，37oC过夜，这也就是纯包埋剂浸透。 次日，升温到60oC48小时固化。 固化完毕，关温箱，自然冷却。 去掉外壳，取出组织包埋块将组织包埋块，存放在干燥器中。 45定向包埋：注意事项防潮、干燥。包埋剂要充分混匀。防气泡。包埋后立即清洗器皿。自身保护。干燥器中存放包埋块。 46（6）切片1）选择和清洗载网。常用的载网有圆形的铜网，细胞化学和免疫组织化学常用镍网、不锈钢网和银丝网。

14、直径为3mm，目数为200-300 472） 支持膜的制备： 福尔莫瓦膜：常用氯仿配制的 0.2%-1.5%的聚乙烯醇缩甲醛液（formrar）。注：制膜时室内的温度小于60%，否则会出现白点。 火棉胶膜：特点，火棉胶膜的机械强度比福尔莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸异戊酯溶液采用漏斗法和贴附法制膜。 帕罗丁支持膜：目前国外比较常用，一般配制30%左右的帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉胶同。 碳膜：炭膜的机械程度和稳定性较好，适用于高分辨率的观察，用真空喷镀仪采用碳升华喷镀法制备。 复合膜：有机膜上喷镀5-10nm的碳膜。 微孔支持膜：高分辨率观察使用。482） 包埋块修整：修成四面锥

15、体（45oC角）495）超薄切片机的构造 6）切片操作 7） 切片厚度: 灰色 40-50nm 银灰色 50-70nm 金黄色 70-90nm 紫色 90nm以上50(7)染色1） 常用的电子染色剂醋酸铀(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，对光不稳定，储存、染色最好闭光，变混则失效。广泛使用，能产生较高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差；对糖分、分泌颗粒、溶酶体等也能染色，但对膜的结构染色较差。常用浓度：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的时间：组织块染色时间为1-2h或过夜。片染30min即可。 51枸橼酸铅（lead acetate）：特点：毒性大。与空气中的二氧化碳结合形成白色的碳酸铅沉淀。高PH（11-12）染色效果好。也是目前最广泛使用的染色液。它具有很高的电子密度，对细胞超微结构均有广泛的亲和性，能提高细胞膜系统及酯类的反差。枸橼酸铅（lead citrate）溶液的配制硝酸铅Pb(NO3)2 1.33g枸橼酸钠Na3(C6H6O7).2H2O 1.76g双蒸水 30ml混合后振荡30min呈乳白色，加1.0mol/L新鲜