热应激对慢性粒细胞白血病细胞系K562中热休克蛋白gp96表达的影响

1、热应激对慢性粒细胞白血病细胞系K562中热休克卵白gp96表达的影响王昕，史斌，王申五，董建强，崔建英，韩淑霞【摘要】本研究查明差异热应激条件对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中热休克卵白gp96表达量的影响，为探求增长K562细胞中gp96的提取量的最正确热应激条件提供实行根据。用免疫构造化学要领检测经38、40、42、44、46及48水浴热休克处置惩罚30分钟后的K562细胞中gp96表达量的变革；以均匀阳性细胞百分率宁静均荧光强度为指标，用流式细胞术研究40、44、48及52各水浴热休克处置惩罚30分钟对K562细胞中gp96表达量的影响；利用免疫印记原理，用esternblt技能研究

2、K562细胞经40、44、48与52水浴各休克处置惩罚30分钟后gp96表达量的变革。效果表白：免疫构造化学要领表现gp96重要在胞浆内表达，在48水浴热休克处置惩罚30分钟时，强阳性的细胞数最多，积分也最高；流式细胞术表现均匀阳性细胞百分率宁静均荧光强度均在48水浴热休克处置惩罚30分钟组达岑岭，各温度间gp96表达量的差异有统计学意义；esternblt表现48水浴热休克处置惩罚30分钟时gp96的表达量到达岑岭，各温度间gp96表达量的差异有统计学意义。结论：48水浴热休克处置惩罚30分钟，gp96在K562细胞中的表达量到达岑岭，该条件可作为提取K562细胞gp96的一个有用预处置惩罚

3、条件。【关键词】慢性粒细胞白血病；热休克卵白；gp96；肿瘤免疫；热应激EffetfHeatStressnExpressinfgp96inK562ellLinefthehrniyelidLeukeiaandItsSignifianeKeyrdsL;heatshkprtein;gp96;turiune;heatstress热休克卵白heatshkprtein，HSP又称应激卵白，具有高度守旧性，高温及别的应激因素均能诱导其表达增长，它有多个家属。比年来的研究表白，热休克卵白gp96到场机体的固有免疫和特异性免疫也称顺应性免疫，能从两大途径引发机体的抗肿瘤免疫1，为慢性粒细胞白血病的生物治疗提供了

4、新的思绪。为满意进一步的底子和临床研究需求，需有大量的gp96，而现有的提取要领服从很低，很难满意研究必要。为此，本研究欲通过免疫构造化学、流式细胞术和esternblt技能，研究差异热应激条件对K562细胞中gp96表达量的影响，探求出最正确热应激条件，为下一步增长提取gp96的量探究预处置惩罚条件，这是进一步研究慢性粒细胞白血病生物治疗的条件。质料和要领抗体及试剂gp96大鼠单克隆抗体大鼠抗人为美国Near-kers公司产物，辣根过氧化物酶HRP标识表记标帜的抗大鼠IgG二抗及FIT标识表记标帜的抗大鼠IgG二抗为美国KPL公司产物，均购自晶美公司。DAB试剂盒和关闭用的正常羊血清购自北京

5、中山生物技能，Ttitn-X100及Teen-20均为美国Siga公司产物，RPI1640造就液购自美国Gib公司。溶血素、破膜剂、BSA及流式细胞仪均为BetinDi-kinsn公司产物。BA卵白检测试剂盒购自美国Piere公司，预染的卵白分子量尺度购自Ferentas公司，混淆发光试剂盒为Santaruz公司产物，TEED、SDS、PSF、甘氨酸等均购自美国Siga公司。细胞系及造就条件细胞系为慢性粒细胞白血病K562细胞系。K562细胞系由本实行室冻存，清醒后置于底面积为752的造就瓶内，参加RPI1640造就液及10%的胎牛血清，于37、5%2、饱和湿度条件下造就，24-48小时传代1

6、次。gp96表达的免疫构造化学检测检测要领将K562细胞造就达对数生恒久后，制备成细胞悬液，调解浓度至1105/l，等量分装后别离于38、40、42、44、46及48恒温水浴箱热休克处置惩罚30分钟后，各温度细胞用离心涂片机甩片，多聚甲醛室温结实后-20备用。将标本各温度切片置于湿盒内以下同，用3%的H2237孵育30分钟，PBST漂洗3次；0.3%的Tritn-X10037孵育30分钟，PBST漂洗3次；用关闭血清于37关闭30分钟；弃血清后加1100的gp96大鼠单克隆抗体4留宿，PBST漂洗3次；加1150的HRP标识表记标帜的抗大鼠IgG37孵育30分钟，PBST漂洗3次；DAB显色。

7、标本末了用苏木素染液复染2分钟，泡洗约2分钟、晾干，以中性树胶封片，照相。光学显微镜400倍下计数5-10个视野的细胞、阳性细胞占所计数细胞的比值为百分率。标本设阴性比较，即不加一抗，用PBS取代一抗，别的步调同上。评分尺度差异热应激条件下，按照K562细胞中棕黄色沉淀颜色深浅、所占胞浆面积的巨细分为3个品级：浅棕色、所占胞浆面积1/2以下为弱阳性+，积分为1；棕色、所占胞浆面积1/2-2/3为中阳性+，积分为2；深棕色、所占胞浆面积2/3以上为强阳性+，积分为3。盘算差异温度下差异阳性品级的积分总和百分率均值乘以积分品级及全部阳性细胞的积分总和各品级积分相加。gp96表达的流式细胞术检测检测

8、要领劳绩对数生恒久的K562细胞悬液，等量分装为4管，别离于40、44、48及52恒温水浴箱热休克处置惩罚30分钟，将每管的细胞悬液平分入A、B两管流式上机管，使细胞浓度为5105/l；A管为比较管，B管为实行管，各管加溶血素结实10分钟，离心后弃上清，再加破膜剂0.5l结实后离心弃上清，然后每B管参加1100的一抗37恒温孵育30分钟，各组A、B管再参加1100的FIT标识表记标帜的二抗37孵育30分钟。然后取出各管，参加含1%BSA的PBS离心后弃上清，取0.5l的PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。评价尺度阳性细胞的百分率指表达gp96的细胞占全部细胞的百分率，反响表达gp96的细胞数目的

9、几多；阳性细胞的均匀荧光强度指单元细胞表达gp96的强度，反响每个细胞表达gp96的量。gp96表达的esternblt检测检测要领劳绩对数生恒久的K562细胞悬液，PBS洗3次后别离于40、44、48与52热休克处置惩罚30分钟，离心后参加5倍细胞沉淀体积的预冷的RIPA裂解液，旋涡震荡混淆器充实混淆后，冰上安排30分钟，超声粉碎机裂解后冰上再孵30分钟，离心后留取上清，-80保存备用。用BA卵白检测试剂盒测定样品浓度，制备SDS凝胶本实行利用12%的分散胶，然后等卵白总量上样、电泳、转膜、关闭留宿、杂交孵育抗体一抗gp96稀释度1200，atin1400;二抗gp96稀释度15000，at

10、in12500；一抗室温孵育2小时，TBST洗3次，二抗室温孵育1小时，TBST洗3次，末了暗室中用混淆发光试剂显影在胶片上，按照发光强度调解曝光时间。评价尺度凝胶成像软件阐发胶片上条带的灰密度积分，用gp96条带的灰度积分除以相应泳道的atin的灰度积分，二者的比值最高表现该组刺激条件下gp96的表达量最高。统计学处置惩罚数据用SPSS10.0医用统计学软件处置惩罚。全部数据举行正态查验和方差齐性查验，复合正态、方差齐的举行单因素方差阐发，差异成心义时组间差异两两比力接纳Q查验；方差不齐时，接纳秩和查验，差异成心义时举行两两比力。数据以均数尺度差(XSD)、均匀秩次来表现。P0.05表现差异

11、有统计学意义，P0.01表现差异有非常明显的统计学意义。效果K562中gp96表达的构造化学检测效果在48水浴30分钟这一热应激条件下，gp96强阳性细胞+的百分率均值为35%，积分总和为105，全部阳性细胞+，+，+的积分总和为202，均在各组中最高。在38-48之间差异刺激条件下，K562中gp96的表达量有所变革，在48组表达量最高图1，表1。Table1.eanperentageandintegralfpsitivegp96ellsunderdifferentheatstressinK562ellline(略)K562中gp96表达的流式细胞术检测效果阳性细胞的百分率各组阳性细胞的百分

12、率资料方差不齐，实行效果经秩和查验法统计处置惩罚。百分率随着温度的变革而变革，在40-52之间渐渐增高，均匀秩次别离为6.00，18.80，30.08，26.40，总的来说各温度之间的P=0.000，0.01，差异有非常明显的统计学意义。组间两两比力，40与44P=0.001，40与48P=0.000，40与52之间P=0.000，P“均0.01，差异有非常明显的统计学意义；44与48之间P=0.002，0.01，差异有非常明显的统计学意义，但与52之间P=0.096，0.05，差异无统计学意义；48与52之间P=0.326，0.05，差异无统计学意义。由于48与52组间差异无统计学意义，可以

13、说48水浴30分钟K562中表达gp96的阳性细胞百分率最高，该组刺激条件可以作为提取gp96的有用预处置惩罚条件图2，表2。Table2.eanrankfpsitivegp96ellperentageinK562underdifferentheatstress略阳性细胞均匀荧光强度K562中gp96表达的esternblt检测效果Gp96条带的灰度积分除以相应Atin的灰度积分的比值资料切合正态漫衍，方差齐，接纳单因素方差阐发。比值均数：40组为0.806，44组为0.830，48组为1.571，52组为2.064，总的来说各温度之间的P=0.000，0.01，差异有非常明显的统计学意义。组

14、间两两比力，40与44间P=0.938，0.05，差异无统计学意义，但与48间P=0.016，与52之间P=0.000，P均0.01，差异有非常明显的统计学意义；44与48之间P=0.019，与52之间P=0.000，P均0.05，差异有明显的统计学意义；48与52之间P=0.107，0.05，差异无统计学意义。由于48与52组间差异无统计学意义，可以说48水浴30分钟K562中gp96的表达量最高，该组刺激条件下96的表达量最高，可以作为提取gp96的有用预处置惩罚条件图3，表4。Table4.Ratifgp96tatininK562ellsunderdifferentheatstress(

15、略)讨论热休克蛋HSP是一个具有差异分子量和细胞内定位的各人族卵白质，在进化中高度守旧。热休克卵白gp96是HSP-90家属的一个成员，重要存在于细胞浆的内质网。如今，在免疫学中gp96介导的肿瘤排挤机制的研究表白：它以两种方法到场机体的固有免疫和特异性免疫也称顺应性免疫，能从两大途径引发机体的抗肿瘤免疫。1，2，3。在许多动物肿瘤模子如肝癌、结肠癌、玄色素瘤、前线腺癌等中，均已证明HSP的防范和治疗作用；比年来，从人类玄色素瘤和结肠癌中纯化的gp96已被证明，它可以或许将抗原肽呈递给D8+的T细胞，在体表里的实行中均能激该死T细胞，引发抗原特异的免疫应答4。基于以上底子和临床研究，我们实行为

16、慢性粒细胞白血病的免疫治疗探求一种新的要领，但是进一步的研究的条件是必要大量的gp96。要办理这一题目，可以从两方面入手：第一，在提取gp96前，对提取物举行预处置惩罚，增长gp96的表达量；第二，革新现有的提取要领来增长提取量。对付提取要领，比年来，Arnld-Shild等5提出了一种新的提取要领，其底子是热疗。比年来，热疗的生物学希望使肿瘤热疗成为肿瘤综合治疗的本领之一，重要缘故原由在于热疗不但可以或许引起细胞质膜的团体损伤和布局粉碎6，并且热疗自己能加强T淋巴细胞、B淋巴细胞以及NK细胞的抗肿瘤活性，从而加强机体免疫监视成效7，同时在热疗时产生的热休克卵白可全面激活机体的免疫体系。HSP

17、-肽复合物在热疗中产生，经H-I类分子及巨嗜细胞的加工能为TL细胞识别而产生特异性免疫8，9，从而对体内同时存在的肿瘤细胞起到猛烈的杀伤作用。现有的研究表白，热休克卵白gp96在热休克，糖饥饿及应激因子如肿瘤坏死因子TNF-、滋扰素和INF-和INF-、2-巯基乙醇等应激条件下表达均增长10。基于以上研究效果，我们选择了热应激作为提取gp96的预处置惩罚条件。外洋aki等人用Nr-thernblt法曾在RNA程度上研究过热应激对gp96表达量的影响，他们报道42，1小时热休克处置惩罚后gp96的表达量比处置惩罚前增长，然而比力体系地研究热应激对gp96表达量影响的事情，如今国表里尚未见报道。本实行选用免疫构造化学、免疫荧光和免疫印记3种要领研究热应激对gp96表达量的影响。免疫构造化学要领从形态学上，直不雅地记载了差异热应激条件下，gp96表达量的变革，创造从38-48之间，gp96的表达量有着显着的变革，在48时强阳性细胞数最多，积分也最高，说明在这一热应激范畴内，即gp96在48，30分钟这一热应激条件下表达最高。为了验证这一趋势，我们方案了第二种要领，通过流式细胞术，利用免疫荧光的原理，不雅察阳性细胞百分率宁静均荧光强