实验01植物细胞渗透势的测定

1、实验01 植物细胞渗透势的测定植物细胞的渗透势主要取决于细胞液的溶质浓度，因此又称溶质势。已知在干旱、盐渍等条件下，一些植物常在细胞内主动积累溶质，以降低其渗透势，增加吸水能力，而在一定程度上维持膨压，保障细胞的生长和气孔的开放，这种现象叫做渗透调节作用。渗透调节能力的大小可以用逆境条件下细胞渗透势的降低值来表示，在水分生理与抗性生理研究中经常需要测定。以下介绍两种测定方法。一、质壁分离法测定植物细胞的渗透势【原理】将植物组织放入一系列不同浓度的蔗糖溶液中，经过一段时间，植物细胞与蔗糖溶液间将达到渗透平衡状态。如果在某一溶液中细胞脱水达到平衡时刚好处于临界质壁分离状态，则细胞的压力势p下降为零

2、。此时细胞液的渗透势s等于外液的渗透势s0，即s=s0，此溶液称为该组织的等渗溶液，其浓度称为该组织的等渗浓度，因此，只要测出植物组织的等渗浓度，即可计算出细胞液的渗透势s。实际测定时，由于临界质壁分离状态难以在显微镜下直接观察到，故一般均以初始质壁分离作为判断等渗浓度的标准。处于初始质壁分离状态的细胞体积，比吸水饱和时略小，故细胞液浓缩而渗透势略低于吸水饱和时的渗透势，此种状态下的渗透势称基态渗透势。【仪器与用具】显微镜1台；载玻片与盖玻片各若干；温度计1支；尖头镊子1把；刀片1片；小培养皿（直径6cm）9套；试剂瓶若干；烧杯、容量瓶、量筒、吸管等；吸水纸适量。【试剂】1mol/kg H2O

3、蔗糖溶液 称取预先在6080下烘干的蔗糖34.2g溶于100g蒸馏水中，即为1质量摩尔浓度蔗糖溶液。蔗糖系列标准液 取干燥洁净的小试剂瓶9支编号，用1mol/kg H2O蔗糖溶液依C1V1=C2V2公式配制0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70mol/kg H2O等一系列不同浓度的蔗糖溶液（具体范围可根据材料不同而加以调整），贮于试剂瓶中，瓶口加塞以防蒸发浓缩。0.03%中性红溶液。【方法】1选大葱或洋葱鳞茎内表皮、小麦叶片等作实验材料。2取干燥洁净的培养皿9套编号，将配制好的不同浓度蔗糖溶液按顺序加入各培养皿中使成一薄层，盖好培养皿盖备用。3

4、用镊子剥取供试材料下表皮或用刀片小心刮取小麦叶片上表皮（参考实验1），大小以0.5cm2为宜。吸去切片表面水分，立即浸入不同浓度的蔗糖溶液中，每一浓度45片。为便于观察，可先将切片于0.03%中性红内染色5min左右，吸去水分，再浸入蔗糖溶液中，但如不加染色即能区别质壁分离时，仍以不染色为宜。4切片在蔗糖溶液中浸泡2030min，同时记录室温，取出放在载玻片上，滴一滴相同浓度的糖液，盖好盖玻片，显微镜下观察确定引起50%以上细胞发生初始质壁分离（即原生质体刚从细胞壁的角隅分离）的浓度，每片观察的细胞不应少于100个，观察要迅速。如果在两个相邻浓度的切片中，一个没有发生质壁分离或质壁分离的细胞不

5、足50%，另一个发生质壁分离的细胞数超过50%，则可粗略地将这两个浓度的平均值作为其等渗浓度，也可用插值法更准确地确定等渗浓度。检查时可先从中间浓度开始。5由所得到的等渗浓度和测定的室温，可用下式计算细胞液的渗透势（s）：s =iCRT式中各参数的意义见实验5（植物组织水势的测定）。6也可用CaCl2或NaCl代替蔗糖，但须改变式中等渗系数。CaCl2的i值可用2.6，NaCl一般为1.8（见附录四）。7试比较不同植物材料的渗透势，把结果列于表6-1：表6-1 测定植物组织渗透势记载表蔗糖克分子浓度（M）渗透势（巴）质壁分离的相对程度（作图表示）0.700.650.600.550.50.450

6、.400.350.30【思考题】1配制蔗糖溶液时为何用质量摩尔浓度（mol/kg H2O）而不用容积摩尔浓度mol/L？2某植物叶片吸水饱和时的渗透势经测定为-0.8MPa，又用质壁分离法测出其渗透势为-0.9MPa，请计算质壁分离状态的细胞液体积相当于饱和时的百分数。实验02 植物的无土培养和缺素症状植物正常生长发育需要多种矿质元素。但要确定各种元素是否为植物所必需，必需借助无土培养法（溶液培养和砂基培养法）才能解决。近年来，无土栽培不仅作为一种研究手段，而且成为新的生产方式，在蔬菜、花卉生产中开始大规模应用。本实验学习溶液培养的技术，并证明氮、磷、钾、钙、镁、铁诸元素对植物生长发育的重要性

7、。【原理】用植物必需的矿质元素按一定比例配成培养液来培养植物，可使植物正常生长发育，如缺少某一必需元素，则会表现出缺素症；将所缺元素加入培养液中，缺素症状又可逐渐消失。【仪器与用具】25ml和500ml烧杯各1个；吸量管1ml 1支，5ml 10支；1000ml 量筒1个；培养瓶（可用1000ml塑料广口瓶或瓷质、玻璃质培养缸）个；黑色蜡光纸适量；塑料纱网纱布（15cm15cm）1块；精密p试纸（p56）或广泛p指示剂；搪瓷盘（带盖）个；石英砂适量；陶质花盆个；500ml试剂瓶11个。【试剂】表11-1 大量元素贮备液配制表营养盐浓度（g/L）Ca(NO3)24H2O236.0KNO3102.

8、0MgSO47H2O98.0KH2PO427.0K2SO488.0CaCl2111.0NaH2PO424.0NaNO3170.0Na2SO421.0EDTA-FeEDTA-Na7.45FeSO47H2O5.57硝酸钾；硫酸镁；磷酸二氢钾；硫酸钾；硫酸钠；磷酸二氢钠；硝酸钠；硝酸钙；氯化钙；硫酸亚铁；硼酸；氯化锰；硫酸铜；硫酸锌；钼酸；盐酸；乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na）。以上试剂均需分析纯。【方法】1.精选高活力玉米（或番茄、向日葵）种子为试验材料。2.培苗：用搪瓷盘装入一定量的石英砂或洁净的河沙，将已浸种一夜的玉米（或番茄）等种子均匀地排列在砂面上，再覆盖一层石英砂，保持湿润，然后放置在温

9、暖处发芽。第一片真叶完全展开后，选择生长一致的幼苗，小心地移植到各种缺素培养液中。移植时注意勿损伤根系。3.配制大量元素及铁贮备液：用蒸馏水按表11-1配制。微量元素贮备液按以下配方配制：称取H3BO4 2.86g，MnCl24H2O 1.81g，CuSO45H2O 0.08g，ZnSO47H2O 0.22g，H2MoO4H2O 0.09g，溶于1L蒸馏水中。表11-2 完全培养液和各种缺素培养液配制表贮备液每100ml培养液中各种贮备液的用量(ml)完全缺N缺P缺K缺Ca缺Mg缺FeCa(NO3)20.5-0.50.5-0.50.5KNO30.5-0.5-0.50.50.5MgSO40.50

10、.50.50.50.5-0.5KH2PO40.50.5-0.50.50.5K2SO4-0.50.1-CaCl2-0.5-NaH2PO4-0.5-NaNO3-0.50.5-Na2SO4-0.5-EDTA-Fe0.50.50.50.50.50.5-微量元素0.10.10.10.10.10.10.1配好以上贮备液后，再按表11-2配成完全培养液或缺乏某元素的培养液（用蒸馏水）。（调节pH至5.55.8）。4.取7个1000毫升塑料广口瓶，分别装入配制的完全培养液及各种缺素培养液900ml，贴上标签，写明日期。然后把各瓶用黑色蜡光纸或黑纸包起来（黑面向里），或用报纸包三层，用0.3mm的橡胶垫做成瓶盖

11、，并用打孔器在瓶盖中间打一圆孔，把选好的植株去掉胚乳，并用棉花缠裹住茎基部，小心地通过圆孔固定在瓶盖上，使整个根系浸入培养液中，装好后将培养瓶放在阳光充足、温度适宜（2025）的地方，培养34周。5.实验开始后每两天观察一次，并用精密pH试纸检查培养液的pH值，如高于6，应用稀盐酸调整到56之间。为了使根系氧气充足，每天定时向培养液中充气，或在盖与溶液间保留一定空隙，以利通气。培养液每隔一周需更换一次。注意记录缺乏必需元素时所表现的症状和最先出现症状的部位。待各缺素培养液中的幼苗表现出明显症状后，可把缺素培养液一律更换为完全培养液，观察症状逐渐消失的情况，并记录结果。【思考题】1.为什么说无土

12、培养是研究矿质营养的重要方法?2.比较溶液培养和砂基培养的优缺点。3.进行溶液培养或砂基培养有时会失败，主要原因何在?实验03-04 植物激素对愈伤组织形成和分化的影响在植物组织培养中，原已分化的外植体（根、茎、叶、花、果实、种子、花粉等）细胞，又能重新进行分裂生长，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这个过程称为脱分化。愈伤组织经过继代培养后又可分化形成根和芽，称为再分化。植物激素在“再分化”中起重要作用。【原理】 愈伤组织分化根和芽受培养基中生长素和细胞分裂素的相对浓度的影响，生长素/细胞分裂素比值高时，促进根的分化；比值低时，则促进芽的分化；两种激素比值适中时，则愈伤组织生长占优势或不

13、分化。这样，通过改变两种激素的相对浓度即可有效地调节愈伤组织再分化的进程。【仪器与用具】超净工作台；高压灭菌锅1个；手术刀一把；长柄镊子1把；三角瓶4 支； 容量瓶：25ml、50ml、500ml、1000ml各1支；吸量管：1ml、2ml、5ml、10ml各1支；培养皿1个；下口杯1个；烧杯1000ml 1个；酒精灯1个；牛皮纸；白线绳；培养室。【试剂】75乙醇；1次氯酸纳；1mol/L HCI；琼脂；6-苄基腺嘌呤；萘乙酸；MS培养基中各种化合物（配方见附录七）。【方法】1.配制培养基按MS培养基配方（见附录七），先配制各母液。(1)按表36-1，配置10倍的大量元素母液：表36-1 10

14、倍的大量元素母液配置表无机盐NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO4重量(g)16.5194.43.71.7用蒸馏水溶解并定容至1000ml。(2)按表36-2配置100倍的微量元素母液：用蒸馏水溶解并定容至1000ml。(3)200倍的铁盐母液：称EDTA-Na2 3.37g，FeSO47H2O 2.78g，用蒸馏水溶解并定容至500ml。(4)有机成分：20mg/ml的肌醇溶液 称取2g肌醇，用蒸馏水溶解后定容至100ml。0.5mg/ml的烟酸溶液 称取12.5mg的烟酸，用蒸馏水溶解后定容至25ml。1mg/ml的甘氨酸溶液 称取25mg甘氨酸，用蒸馏水溶解

15、后定容至25ml。表35-2 100倍的微量元素母液配置表无机盐重量（mg）KI83H3BO4620MnSO44H2O2230ZnSO47H2O860Na2MoO42H2O25CuSO45H2O2.5CoCl26H2O2.50.5mg/ml的盐酸吡哆醇（维生素B6） 称取12.5mg盐酸吡哆醇，用蒸馏水溶解后定容至25ml。0.1mg/ml的盐酸硫胺素（维生素B1） 称取10mg盐酸硫胺素，用蒸馏水溶解后定容至100ml。(5)植物激素：0.1mg/ml的萘乙酸溶液 称取10mg NAA，用少量95乙醇溶解后，用蒸馏水定容至100ml。1mg/ml 6-苄基腺嘌呤 称取50mg6-BA，用少量

16、1mol/L的HCl溶解后，用蒸馏水定容至50ml。将各种元素的母液混合，配制成MS培养基，其中1升体积中所含各种元素的母液含量如表36-3：表36-3 1L MS培养基中各种元素的母液含量大量元素母液100ml微量元素母液10ml铁盐母液5m l肌醇母液5ml甘氨酸母液2ml烟酸母液1ml盐酸吡哆醇母液1ml蔗糖30g盐酸硫胺素母液1ml琼脂9g再按表36-4分别加入NAA和6-BA母液：表36-4 培养基14加入NAA、6-BA配置表培养基1234NAA母液0.1ml0.2ml0.1ml06-BA母液3ml3ml03ml先在三角烧杯（或不锈钢锅）加入600ml蒸馏水，加入所需的琼脂和糖，在

17、水浴锅里将琼脂溶化，如果直接加热应不停地搅拌，防止在瓶底（或锅底）烧焦或沸腾溢出。再将溶解的琼脂糖溶液倒入盛有上述各种物质母液的下口杯中，混匀，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH至5.8，用蒸馏水定容至1升。将培养基分注到三角瓶或试管中，按容器的大小和培养要求放入适当量的培养基。分装时注意不要把培养基沾附到瓶口或管口附近的内壁上，以免培养过程中发生污染。分装中还要不时搅动下口杯中的培养基，否则先后分装的各瓶培养基凝固能力不同。盖上棉塞，用牛皮纸包扎好后，放入高压灭菌锅，1.2大气压下灭菌15min，冷却后备用。2.材料的灭菌与接种取开花前23天已露白的菊花花蕾，先用自来水冲洗

18、花蕾，然后在75乙醇中浸泡15秒钟，后用无菌水冲洗2次，再用1次氯酸纳溶液浸泡15min，并不时轻轻搅动。用无菌水清洗三次，再转入放有滤纸而又无菌的培养皿中，用剪刀剪取舌状花，用解剖刀切取舌状花的5毫米见方大小的小块，一个100ml的三角瓶中68个小块。接种后放到培养室中培养。培养室内的温度为252，日光灯每天照明12h，光照强度约2000lx。3.结果观察和记录接种后注意观察记录外植体上愈伤组织和根芽出现的时间和数量，加以分析比较。【注意事项】1.在配制植物激素时，溶解试剂的乙醇和盐酸用量要少，用蒸馏水稀释时，慢慢沿烧杯内壁加入。2.对培养基和材料及器皿的灭菌要严格。3.分装培养基时，不能把

19、培养基沾附到瓶口上，以免引起污染。4.在温室内培养过程中，经常检查，及时剔除污染的材料或三角瓶。【思考题】1.植物激素与愈伤组织形成和器官分化有何关系？2.在组织培养过程中应注意些什么？实验05 叶绿体色素的提取分离和理化性质一、叶绿体色素的提取与分离【原理】 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具

20、有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。【仪器与用具】研钵2套；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培养皿（直径11cm）；康维皿或平底短玻管（也可用塑料药瓶盖代替）；药勺；圆形滤纸（直径11cm）；滤纸条（5cm1.5cm）。【试剂】95%乙醇；石英砂；碳酸钙粉；推动剂：按石油醚丙酮苯（1021）比例配制（体积比）。【方法】1叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片45片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加23ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加1015ml 95%乙醇，提取35min

21、，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105杀青，再在80下烘干，研成粉末，密闭贮存。用时称叶粉1g放入小烧杯中，加95%乙醇2030ml浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。（3）另取一研钵，放入剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不加碳酸钙粉），用水研磨。先加2ml蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水30ml，搅均，不过滤。2叶绿体色素的分离（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）。另取一张滤纸条（5cm1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色

22、素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿凸出）。（3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿（图16-1）。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。如无康维皿，也可在培养皿中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖，以盛装推动剂。但所用培养皿底、盖直径应相

23、同，且略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。二、叶绿体色素的理化性质【原理】叶绿素是一种二羧酸叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红

24、光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。皂化反应式如下：COOCH3 COOKC32H30ONMg + 2KOH C32H30ON4Mg皂化叶绿素COOC20H39 COOK+ CH3OH + C20H39OH甲醇 叶绿醇【仪器与用具】 20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管

25、2ml、5ml各1支；火柴。【试剂】 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸；醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成；KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。【方法】用本实验第一项中提取的叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。1光对叶绿素的破坏作用（1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。（2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察

26、颜色有何变化，解释其原因。2荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。3皂化作用（绿色素与黄色素的分离）（1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。（2）片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入11.5ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层是苯

27、溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。4吸收光谱的观察 将上述已分层的试管溶液，用分光镜观察两类色素的吸收光谱，首先让下层绿色素部分对准进光孔，看光谱有何变化；然后再将上层黄色素溶液对准进光孔，看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。5H+和Cu+对叶绿素分子中Mg+的取代作用方法一：（1）取两支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2ml，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5ml，再加入5%HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。（2）当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。方法二：另取醋酸醋酸铜溶液20ml，以

28、烧杯盛之。取新鲜植物叶片两片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。【注意事项】1在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在3040的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。2分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。【思考题】1用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取植物材料特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？2研磨提取叶绿素时加入CaCO3有什么作用？3从叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素的吸收光谱讨论其生理

29、意义。实验06 红外线CO2气体分析仪法测定植物光合速率与呼吸速率红外线CO2气体分析仪（IRGA）工作原理：许多由异原子组成的气体分子对红外线都有特异的吸收带。CO2的红外吸收带有四处，其吸收峰分别在2.69m、2.77m、4.26m和14.99m处，其中只有4.26m的吸收带不与H2O的吸收带重叠，红外仪内设置仅让4.26m红外光通过的滤光片，当该波长的红外光经过含有CO2的气体时，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并服从朗伯比尔定律。分别供给红外仪含与不含CO2的气体，红外仪的检测器便可通过检测红外光能量的变化而输出反映CO2浓度的电讯号。.密闭系统斜率法一、原理

30、把IRGA与光合作用同化室连接成密闭的气路系统。将植物材料密封在透明的同化室内，给以适当的光照，同化室内CO2浓度将因植物光合而下降，用IRGA配以适当的记录仪可绘出同化室内CO2浓度随光合时间下降的曲线。在同化室不漏气、光强度稳定、室内空气不断得到搅动的情况下，该曲线将是一条平滑曲线，在曲线的任一点作切线，即可根据切线的斜率，密闭系统的容积和同化室面积求出在该点的CO2浓度下的光合速率。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片（二）仪器设备：1. 密闭气路光合测定装置：将QGD07型红外线CO2气体分析仪、XWT264型自动记录仪、MXQ型气体取样器（图4）、光合作用同化室、温度转换器（

31、测温探头可放在同化室内，输出信号接记录仪）或半导体点温计、橡皮管（内径67mm）、塑料气球，按图6所示连接成套，放在一辆医用小推车上。2. 量子辐射照度计；3. 叶面积仪；4. 铁架台（带试管夹）；5. 050温度计（用以校正叶室温度）；6. 剪刀；7. 带盖搪瓷盘；8. 纱布。（三）试剂：1. 无水氯化钙（无水硫酸钙）；2. 烧碱石棉（10目）或碱石灰。三、实验步骤（一）光合速率的测定1. 安装仪器（1）将安装好的密闭气路光合测定装置安放在靠待测植株12m处，接通红外仪、录仪、取样器、温度转换器的供电电源。打开红外仪电源开关预热12h，红外仪量程开关置于I档（0500ppm，1ppm1mg/

32、L）。把红外仪和温度转换器的信号输出与记录仪的两个信号输入接线柱用导线接通。旋转记录仪第一支笔量程选择开关于10mV位置（与红外仪输出信号电压匹配），旋转记录仪第二支笔量程选择开关于2V位置（与温度转换器输出温度050信号电压匹配）。2. 调、校仪器（1）红外仪预热完毕后，开启记录仪电源开关、记录仪信号输入开关和取样器前面板上的气泵开关，将取样器F1旋钮置“零气”位置，F2旋钮置“测量”位置，开始调整红外仪的零点（此时，无CO2无水分的零气循环经过红外仪），约12min，调节红外仪的调零旋钮使指针稳定在“0”点位置，稳定后，调节记录仪第一支笔的“调零”旋钮使记录笔到零点位置，红外仪调零完毕。（

33、2）拔下红外仪进气口处的橡皮管，改接CO2标准气（已知准确CO2浓度）钢瓶，出口放空，让标准气流经红外仪分析气室（流量以1Lmin左右为宜）开始校正，此时红外仪指针应指在标准气浓度所对应的刻度（A值）上，否则可调节红外仪“校正”旋钮，校正完毕后恢复原气路。（3）把玻璃温度计感温端与叶室内的温度转换器探头放在一起（注意遮荫），从玻璃温度计上读出温度，迅速旋转记录仪第二支笔的调零旋钮，使记录笔置该温度所对应的位置，校正温度。3. 测定（1）旋转取样器面板上F1旋钮至“测量”位置，把植物叶片平展放入同化室后关闭同化室（注意勿让操作者的呼吸气进入叶室），开启叶室风扇。观察记录笔开始左移时，迅速旋转记录

34、仪“走纸变速”开关至合适档（以所划曲线45角为宜），开始记录CO2浓度变化（此时记录笔应从350ppm左右开始记录）和温度变化，用铅笔在记录纸上记下所测叶片的编号、走纸速度，用量子辐射照度计测量所测叶片的受光强度（光子通量密度）并记录，待记录笔左移至310ppm左右时，关闭走纸开关，停止记录，第一次测定完毕。（2）旋转取样器面板上的F2旋钮至“补充”位置后，迅速复原，让气球内的高浓度CO2气进入同化室以补充CO2浓度至350ppm左右，观察记录笔左移后迅速开启走纸开关，进行第二次重复测定，测量光照强度并记录，当记录笔左移至310ppm左右时，关闭走纸开关，第二次重复测定完毕。如此再进行第三次重

35、复测定。（3）三次重复测定完毕后，关闭同化室内风扇，用记号笔在叶片的叶室内外相交处作标记，打开叶室，剪下叶片的测定部分，用纸牌编号后包在湿纱布内并放置于带盖搪瓷盘内，待测叶面积。然后再测定第二张叶片的光合速率。（4）测定结束后，用叶面积仪测定各叶片面积（如有便携式叶面积仪，可在测定光合后，立即测出叶面积）。 4. 计算II.密闭系统落差法原理在密闭的系统中，由于同化室中的叶片进行光合后，系统中的CO2浓度不断下降，可用单位时间内同化室中CO2浓度的减少量或CO2浓度减少量所需的时间，根据叶片面积、同化室体积，计算光合速率。二、材料、仪器设备及试剂材料：待测植物叶片。（二）仪器设备：1.GXH3

36、05型红外线CO2气体分析仪（或QGD07型红外仪，使用该红外仪需要配用MXQ气体取样器和数字万用电表）；2.电子秒表；3.同化室（根据需要自制，内装两个小风扇和一个测定温度的传感器）；4.量子辐射照度计。（三）试剂：烧碱石棉或碱石灰。三、实验步骤1. 按要求将气路系统的各部分连接起来，若使用QGD07型红外仪，把数字万用电表上选择开关旋至200mV电压档上，与红外仪0200mV输出相连接。2. 接通电源，打开红外仪电源预热12h，打开气泵电源，旋转零气调节开关至“零点”上，此时红外仪通入无CO2气体，调节红外仪“调零”旋钮，显示在“零点”位置，并观察零点的稳定性。3. 将待测叶片放入同化室，

37、密闭后开启同化室内的风扇，当CO2浓度稳定下降时，开始测定，读取开始的CO2浓度值C1，开始计时，CO2下降至C2（约下降2030ppm），终止计时，记录C1、C2、t（或确定从测定开始到结束所需时间），并同时用照度计测定光照强度，测定叶室内的温度。一次测定完成之后，向同化室内补充CO2，进行重复测定（使用MXQ取样器，补充CO2操作见密闭气路斜率法）。测定结束，用叶面积仪测量叶片的面积。4. 计算光合速率PnCV273P/tS22.4(273t)0.1013上式中，Pn光合速率（单位mol/m2/s）；CCO2浓度落差C1C2（ppm）；t测定时间（S）；S叶片面积（单位m2）；V同化室（包

38、括气路系统）体积（单位L）；t同化室的温度；P大气压（单位Mpa）。密闭气路落差法测定装置除了进行光合速率测定外，也能够进行呼吸速率、CO2光合速率曲线的测定。测定步骤同光合速率测定方法。更换群体同化箱，可以进行群体光合速率的测定，测定步骤略。实验07 赤霉素对-淀粉酶的诱导形成原理 淀粉性种子在萌动过程中，胚释放出来的赤霉素能诱导糊粉层细胞中-淀粉酶基因的表达，引起-淀粉酶生物合成，并分泌到胚乳中催化淀粉水解为糖。通过碘试法比色测定淀粉在酶催化反应过程中的消耗量，可以定量分析-淀粉酶的活力。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：大麦、小麦种子 （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 恒温箱

39、；3. 水浴锅；4. 移液管；5. 烧杯；6. 试管；7. 青霉素小瓶；8. 镊子；9. 刀片。 （三）试剂：1. 1%次氯酸钠溶液；2. 0.1%淀粉溶液；3. 2105mol/L、2106mol/L、2107mol/L、2108mol/L 赤霉素溶液；4. 103mol/L 醋酸缓冲液；5. I2-KI溶液。三、实验步骤1. 选取大小一致、健康的大麦种子50粒，用刀片将每粒种子横切成两半，使成无胚的半粒和有胚的半粒，分别置于新配制的1次氯酸钠溶液中，消毒15min，取出用无菌水冲洗数次，备用。 2. 取小瓶6只编好号码，按表（详教材）加入各种溶液和材料，于25下培养24小时（最好进行振荡培

40、养，如无条件，则必须经常摇动小瓶）。3. 淀粉酶活性分析：从每个小瓶中吸取培养液0.1mL，分别置于事先盛有1.9mL淀粉磷酸盐的溶液中，摇匀，在30温箱或水浴中精确保温10min，然后加I2-KI溶液2mL，蒸馏水5mL，充分摇匀，于波长580nm下测定吸光度，以蒸馏水为空白校正仪器零点。读数，从标准曲线查得淀粉含量，以被分解的淀粉量作为淀粉酶的活性。4. 以不同淀粉浓度（07g/L）或淀粉量（0100g）及其吸光度绘制标准曲线。四、结果计算1. 第1瓶为淀粉的原始量（X）。 2. 第26瓶分别为反应后淀粉的剩余量（Y）。3. 淀粉水解量=（XY）/X100%。实验08 根系活力的测定（TT

41、C法）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水本。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。一、 原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂（一）材料：水培或砂培小麦、玉米

42、等植物根系。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 电子顶载天平（感量0.1g）；4. 温箱；5. 研钵；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度试管10ml；11. 试管架；12. 容量瓶10ml；13. 药勺；14. 石英砂适量；15. 烧杯10ml、1000ml。（三）试剂：1. 乙酸乙酯（分析纯）。2. 次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。3.1TTC溶液准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。4. 磷酸缓冲液（115mol/L，pH7）。5. 1mol/L

43、硫酸用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。6. 0.4mol/L琥珀酸称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、实验步骤（1）TTC标准曲线的制作取0.4TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、50g、100g、150g、200g的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，

44、绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37下暗保温13h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/

45、h）四氮唑还原量（mg）/根重（g）时间(h)实验09 类似生长素对种子萌发的影响一、原理 生长素及人工合成的类似物质如萘乙酸等对植物生长有很大的调节作用，在不同浓度下对植物生长的效应也不同。一般来说，低浓度的生长素促进生长，高浓度时则抑制生长。不同的植物器官对生长素的反应也不同，通常根比芽、茎对生长素更敏感。本实验据此观察不同浓度的萘乙酸在种子萌发过程中对植物不同器官生长的影响。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦种子。（二）仪器设备：温箱，培养皿，移液管，镊子，滤纸，尺子。（三）试剂：10mg/L萘乙酸，0.1%升汞。三、实验步骤1. 取小麦种子，用0.1%升汞消毒15min，再用自来

46、水和蒸馏水各冲洗3次，置于22的温箱中催芽2d。2. 取9cm的洁净培养皿7套，编号。在1号培养皿中加入10mg/L 萘乙酸10mL，然后从其中吸取1mL放入2号培养皿中，加9mL蒸馏水混匀后即成为1 mg/L 萘乙酸溶液。如此依次稀释到6号培养皿（最后从第6号培养皿中取出1mL弃去），则1号至6号培养皿中的萘乙酸浓度依次为10 mg/L、1 mg/L、0.1 mg/L、0.01 mg/L、0.001 mg/L、0.0001 mg/L。第7号培养皿中则加入9mL蒸馏水作为对照。3. 在各培养皿中放入一张与培养皿皿底大小一致的滤纸，选取已萌动的小麦种子10粒，用镊子将其整齐地排列在培养皿中，使芽

47、尖朝上并使胚的部位朝向同一侧，盖上皿盖后，放在22的温箱中暗培养3d。4. 测量培养皿内小麦幼芽及幼根的平均长度以及根的数目。四、实验结果计算与分析 以蒸馏水中的材料为对照，计算不同浓度萘乙酸溶液中小麦幼芽及幼根长度的增加或减少值，并填入表中进行比较分析。实验10 植物组织中超氧物歧化酶活力的测定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：2 反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。【原理】本实验依据

48、超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲 。后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲 的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。【试剂】0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；提取介质50mmo

49、l/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1聚乙烯吡咯烷酮）；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml；750mol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存；100mol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；20mol/L核黄素溶液：取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存。【方法】1酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.52

50、ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。2显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）7支，3支为样品测定管，3支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。表39-1 各溶液加入量试 剂（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/L Met溶液750mol/L NBT溶液100mol/L EDTA-Na2液20mol/L核黄素酶 液蒸馏水总体积1.50.30.30.30.30.05

51、0.253.013mmol75mol10mol2.0mol空白和对照管加缓冲液代替酶液3SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性：SOD总活性=SOD比活力=式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；A0照光对照管的消光度值；AS样品管的消光度值；VT样液总体积（ml）；V1测定时样品用量（ml）；FW样重（g）；蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g)。【思考题】1在SOD测定中为什么设照光对照管和暗中空白管？2影响本实验准