高效液相色谱详解郝建涛通用PPT课件

1、高效液相色谱（HPLC）主讲：郝凤霞能源化工重点实验室目 录 基础理论 上机操作前的准备工作 Agillent 1100 的操作 常见故障排除 HPLC在科研中的应用一、基础理论溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。 1、色谱柱的分离原理 色谱分析法的分类按两相的状态分类流动相液体流动相气体固定相固体液体固定相固体液体名称液固色谱液液色谱名称气固色谱气液色谱总称液相色谱总称气相色谱2、分离模式键合相色谱、液液色谱、

2、尺寸排阻色谱键合相色谱正相色谱： 流动相极性 固定相极性常规分析，80 色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。3、HPLC中的基本概念和术语色谱峰

3、(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。保留时间(retention time，tR)-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时

4、间。流动相的洗脱方式等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂梯度洗脱 A 泵进样器色谱柱柱温箱检测器 B泵AB时间B 浓度分析时间长分离度差 MeOH / H2O = 4 / 6MeOH / H2O = 8 / 2等度洗脱95%30%MeOH 浓度梯度洗脱梯度洗脱是 HPLC 的常用手段 梯度洗脱装置 流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序升温技术。4、高效液相色谱法的应用范围 高效液相

5、色谱法适于分析沸点高、相对分子质量大，受热易分解的不稳定有机化合物、生物活性物质以及多种天然产物，这些化合物约占全部有机化合物的80%，可应用于化工生产、制药工业、食品工业、生物化工、医学临床检验和环境监测等领域。5、HPLC的系统输液泵 相当于人的心脏，不断提供连续、稳定、精确的流量进样器 样品引入系统色谱柱 关键部分，在这里样品实现分离检测器 对分离后的样品进行检测数据记录与处理装置数据分析系统输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统HPLC的系统组成Agilent 1100 高效液相色谱仪储液瓶真空脱气机混合室自动进样器分离柱VWD手动进样自动进样六通阀进样演示分离系统色谱柱功能：组

6、分分离目标：分辨力强效率高吸附剂化学键和固定相色谱柱化学键合相色谱柱:70% 将不同的官能团通过化学反应键和到硅胶表面的游离羟基上，而形成化学键和固定相，进而形成化学键和相色谱柱。反相: C18, 65%; C8, 15%; 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。正相: 20%;-NH2、 -CN其它 (手性柱， 离子交换柱): 10%柱温箱控制温度，保证分析结果重现性升高温度，降低了流动相的黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性升温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响 (B27)流动相: A: 含0.05%三氟乙酸的水B: 含0.05%三氟乙酸的乙腈2% B / min进样量: 10

7、0L (50g的6M脲/5%乙酸)UV: 210 nm流速: 1 mL/min室温液相色谱柱: C18色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m室温300C400C500C600C700C提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）检测器选择性紫外(VWD、DAD)荧光电化学通用型示差折光蒸发光散射质谱检测系统药典中的液相检测器 检测器简介（一）紫外吸收检测器（UVD）原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的 变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。特点：选择性检测器、波长检测范围：190-800nm ；对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）；应

8、用最广，对大部分有机化合物有响应；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。定量基础：Lambert-Beer定律，AKbc2022/7/12光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。检测器简介（二）荧光检测器（fluorescence detector） （FLD）原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化

9、合物等有响应。检测器简介（三）检测器简介（四） 蒸发光散射检测器（ELSD）原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。检测器简介（五） 电导检测器（ECD）原理：监测溶液的电导率变化的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。 示差折光

10、指数检测器（RID）原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。特点：通用性检测器，温变化要保持在0.001、灵敏度低（10-6g） 二、上机操作前，我们需要准备好什么？如：样品怎么处理？ 流动相怎么选？ 仪器参数怎么设置？ 1样品的前处理 最好使用流动相溶解样品。 使用预处理除去样品中的强极性或与柱填 料产生不可逆吸附的杂质。 使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。样品准备样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，确保样品中不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小样品过滤头的类型：30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2m和0.45m两种规

11、格材料有，纤维素，醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2m和0.45m两种规格。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。注意：1：每张滤膜只能用一次。 2：水相和有机相不要搞混。2流动相的配制流

12、动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应流动相的黏度要尽量小分离效果好柱压低，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。在流动相配制好后，一定要进行脱气。准备流动相1) 色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇 水超纯水，18.2Mcm过滤装置为什么要过滤？1、对色谱柱、仪器起到保护作用色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细

13、管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。2、消除由于污染对分析结果的影响3) 溶剂准备：脱气目 的流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解气体。 以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。 溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。 若用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污

14、染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。3、流动相流速的选择具体根据色谱柱的内径选择 柱子的内径（5m填料）流速（ml/min）4.61 - 23.00.4 - 0.82.10.2 - 0.41.00.05 - 0.094、波长选择首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道

15、在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。5记录时间第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。三、Agilent 1100 机器操作1、检查流动相Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态Purge阀 逆时针打开清洗阀顺时针关闭清洗阀毛细管出口,流向进样器废液管,清洗阀打开时溶剂由此流向废液瓶.1、检查流动相Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态把流动相放入溶剂瓶中，且滤头浸入到液面下 A 水

16、 B 甲醇 C 乙腈 D 缓冲液2、冲洗管路选择流动相为10异丙醇90水 （按此比例配好溶液后存放在矿泉水瓶中） 调节流速大约为1d/3s。3、打开电脑，等待TAP窗口出现4、打开1100各模块开关指示灯状态每个部件接通电源后LED灯显示绿色关机 power off准备进样 power on没准备好Not Ready运行Run故障Error驻留ResidentBlink仪器LED状态显示电源开关显示黑Black黑Black黄Yellow绿Green红Red黄闪烁Yellow blinking6种LED仪器状态：5、待1100自检完毕，双击online，启动工作站化学工作站自动与1100LC通讯

17、，进入工作站画面。其它功能菜单文件处理运行控制仪器控制序列放弃任务在线帮助工作站任务切换快捷键方法存取快捷键序列存取快捷键运行方法运行序列面对工作站，我该怎么办？What should I do？我们知道要运行样品需要设置控制仪器的参数，比如泵流速、流动相比例、柱温、检测器波长、样品校正等；在Agilent化学工作站中我们把仪器控制和数据分析以及仪器相关的运行等所有参数称为一个方法Method；所以要运行一个样品，首先要得到一个正确的方法；在Agilent化学工作站中要得到方法要么调用一个已经存在的方法，要么自己编辑一个新的方法；一般来说，通过查阅资料比如国家标准或行业标准、药典、专业技术资料

18、、EPA等都可以得到样品分析的详细方法；您需要做的就是把这些方法在Agilent化学工作站中建立起来，然后运行仪器并得到数据。6、方法的编辑1）调用方法在Method中点击Load Method工作站弹出下面对话框.在右面对话框中选中要调用的方法名,点击“OK”,该方法即被激活.使用 Edit Entire Method 编辑一个完整的方法2）编辑一个新方法选择所要编辑的内容画面1:方法组成在你想要的部分前选中,否则方法里将不包括该部分的内容。比如本方法不包括数据分析的内容。方法信息仪器控制与数据采集数据分析运行时间表方法信息 (Method Information)画面2：方法信息输入您想要

19、对方法的说明，比如方法的用途、来源等信息。包括：流量(Flow)，流动相组成(Solvents)，停止采集时间(Stop Time)，梯度编程(Timetable)，压力限制设定(Pressure Limits)泵的操作参数压力限制：Max最高压力，Min最低压力流动相梯度表输入流量(Flow)输入停止采集时间(Stop Time)输入流动相组成，B、C、D可输，A=100-B-C-D输入流动相名称画面3：泵参数（四元泵）检测器参数设置画面5：检测器参数VWD输入使用的波长控温范围：低于室温1080两个单独的加热区。 安装切换阀可以进行柱切换。可以容纳30 cm长色谱柱。安装柱识别可以自动记录

20、进样次数。柱温箱画面6：恒温柱箱参数设置输入控制温度温度编程表从Method菜单选择Save Method / Save Method as或从存贮方法工具图标存贮方法。存贮方法换名保存覆盖保存另存时在此处输入方法名7、样品的测定要分析单个样品, 从RunControl菜单选择 Sample Info., 输入样品信息。样品信息包括：操作者姓名(Operator Name)，存盘数据文件(Data File)，样品参数(Sample Parameters)。然后运行方法(Run Method)。指定样品瓶号及数据路径样品瓶所放位置子目录名称数据形式Manual为手动，Prefix/Counte

21、r为自动累加。从Instrument 菜单选择System on。鼠标左键点击红色或蓝色标题，即可将Y轴显示成对应的相应值和单位8、数据分析从“View ”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面 从“File ”菜单选择“Load signal ” ，选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok。 调用信号文件叠放多个信号文件做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options ”选项。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示时间，单击ok，或选择”Use Ranges ”调整。反复进行，直到图的比例合适为止。 图形优化图形优化Signal O

22、ptions信号选项积 分 从“Integration ”中选择 “Auto integrate ”，如积分结果不理想，再从菜单中选择“Integration Events ”选项，选择合适的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。积分参数优化Integration Events积分参数选项（及快捷键）积分参数Slope Sensitivity设置斜率灵敏度，截除噪音积分Peak Width设置半峰宽度，远大于或小于该数值的峰的积分将被截除Area Reject设置面积截除，截除面积低于此值的峰的积分Height Rejec

23、t设置峰高截除Shoulders设置肩峰参数这是一张优化了积分参数的谱图积分，噪音及杂质积分已被截除。9、打印报告10、回到Method and Run control 可继续测量11、关机1）冲洗管路和色谱柱30min A：水 B：甲醇（如果使用了D缓冲溶液，则用一干净小烧杯盛放超纯水） 流速：5ml/min2）用甲醇2030ml冲洗进样阀3）关闭工作站4）关闭TAP窗口5）关1100的电源6）关电脑7）在大型仪器使用记录本上登记8）关闭实验室的水、电、气及门窗等小结：液相色谱操作步骤倒入流动相，装柱开机：计算机Bootp 开设备打开Chemstation工作站创建（调用）方法排气：打开排气

24、阀，先排有机相、再排无机相，5ml/min流速调至0.1ml/min，拧紧排气阀。平衡柱子：梯度升速至最终流速，基线平直1015min系统平衡后点击“start”开始进样操作结束：10%有机相+90%水洗柱0.5h；再用纯有机相洗0.51h；梯度降速至0ml/min关机、卸柱子四、常见故障排除 液相色谱仪结构复杂，且不同型号的色谱仪，出故障时产生的现象有可能不同，以下罗列的现象仅供参考：现 象原 因排除方法输液泵压力指示为零(或0.5 MPa)且柱后无液体流出。1.柱前导管接头漏液2.泵柱室内有大量气泡存在3.贮液瓶内试剂用完4.输液泵未工作1.检查各接口是否有漏液；2.放开泵出口接头；用“清

25、洗”键冲洗泵体；3.添加流动相；4.按输液泵操作方法，检查其工作状态。 常 见 故 障 排 除现 象原 因排除方法输液泵压力指示超过规定的范围，且柱后无液体流出1.分离柱阻力过大(陈旧柱子)2.柱前导管堵塞3.泵柱塞内有少量气泡存在4.柱子进口处过滤膜堵塞5.进样阀手柄未旋到底(处于中间状态)6.导管中有颗粒状固体堵塞1.更换柱子2.从柱后开始逐级向上拆开接头检查3.拆开泵接头，用“清洗”档赶尽气泡。4.拆开柱前接头、更换或清洗过滤膜5.左右旋动六通阀至极限位置6.逐级检查，并更换导管 常 见 故 障 排 除现 象原 因排除方法柱前压力逐渐升高1.流动相中存在大颗粒的物质2.样品未经过过滤处理

26、3.柱子输入端滤片污染1.流动相经5m的真空抽滤瓶过滤后再使用2.样品须经滤膜过滤3.拆下柱的滤片用超声波清洗，同时刮去柱口表面被污染的固定相基线大幅度波动(即紫外检测器的输出电平值极不稳定)1.流通池内留有大量的气泡2.流通池漏液3.紫外检测器有故障1.排除气泡2.检修流通池3.停止恒流泵工作，检查紫外检测器 现 象原 因排除方法组份峰极小或不出峰1.波长选择不正确2.检测器输出衰减 太大3.进样口漏液4.进样阀样品废液管堵塞，样品未进入定量管 5.进样后未按启动键6.定量管容积过小7.样品浓度过稀8.检测器灯源老化或失效9.流动相不纯1.按标准重新选择波长2.重新选择输出量程范围3.修理进

27、样阀4.拆下六通阀上废液管(5#，6#)重新安装5.进样后立即按启动键6.更换大容量定量管7.浓缩样品后再进样8.更换灯源9.选择高纯度的流动相 常 见 故 障 排 除现 象原 因排除方法温度指示波动11.设置温度值过低2.柱箱密封盖未盖好3.温度控制器未启动4.柱箱升过高温后， 再设置低温5.温控部件有故障6.控温铂电阻接触 不良1.设置最低温度应 室温以上102.检查柱安装过程3.按 起始 键(指示灯 亮)4.开机后会逐渐稳定 (正常现象)5.修理温度控制器6拧紧固定铂电阻引 线的螺钉 常 见 故 障 排 除现 象原 因排除方法检测器开机时屏幕 显示不正常，出现缺字、坐标图形异样、光标无法

28、移动等现象。工作电源不正常或仪器附件有强干扰源存在。1.检查工作电源电压，采取稳压措施2.关机后重新开机3.检测器微机系统故障常见图谱分析 由于液相色谱仪在工作中受到的影响因素较多，因此出现的色谱图形也较为复杂，除与操作者的使用和仪器所处的环境有关外，还与分离柱、流动相性质、分析对象的性质、所选择的工作条件有关。现仅对与仪器性能有关的常见图谱作一粗略分析，供参考。 图 谱分析原因现象说明及排除1.环境温度变化过大2.液流不稳定或有漏液3.在技术指标范围内1.避开室内通风口位 置和发热或制冷源2.观察泵的工作状态, 并查漏3. 110-4Au 图 谱分析原因现象说明及排除1.外界干扰讯号2.输液泵柱室内有气泡3.流通池内有气泡1.使机壳良好接地， 排除附近干扰源2.用“清洗”键或排 放阀排除气泡3.拆下输入导管，大 流量冲洗池体或在 池体出口增加阻力 (接长排液导管)漂移1.仪器在稳定中2.在技术指标范围内3.柱箱升过高温后， 再处于室温工作4.检测器工作不稳定1.正常现象2.属正常状态3.将分离柱从柱箱 内取出后使用4.元器件工作点不稳 定，修理后再使用 图 谱分析原因现象说明及排除1.组份分离不佳 a.色谱柱选择有误 b.流动相不符合分析要求 c.柱后导管过长2.波长选择不正确3.流速过大1.重叠峰 a.更换色谱柱 b.重新选择流动相 c.尽可能