外源性Wnt5a诱导K562细胞分化表型的实验研究

1、外源性Wnt5a诱导K562细胞分化表型的实验研究袁媛，司维柯，李招权，潘静，赵宸【关键词】诱导分化DifferentiatinPhentypesfK562ellsInduedbyExgenusnt5aKeyrdsnt5a；K562；indutindifferentiatin；ntsignalingJExpHeatl2022;15(5):946-949nt家族在个体发育及一些恶性肿瘤的发生、开展中起到重要作用1,2。nt5a属于nt家族成员之一，近年来报道它也与肿瘤的发生亲密相关3，但与白血病的关系报道较少。我们前期的研究发现，nt5a在急性、慢性髓系血病患者的外周血或骨髓以及一些髓系白血病细

2、胞株中均表达缺失或降低，并且外源性的nt5a可抑制K562细胞增殖并有诱导其分化的现象。在此根底上，本研究旨在进一步确证外源性nt5a有诱导K562细胞定向成熟分化的作用，以提醒nt5a在白血病的发生、开展中的作用和机制，为白血病的诊断和治疗提供新的诊断标志物和基因治疗靶点。材料和方法主要试剂外源性nt5a诱导K562细胞分化表型的实验研究RPI1640培养液美国Gib公司产品，小牛血清杭州四季青生物材料研究所产品，小鼠抗人D13、D14、D68单克隆抗体北京中衫生物技术公司产品，二甲亚砜、胰酶美国Gib公司产品。细胞培养人红白血病细胞株K562、中国仓鼠卵巢细胞株H为本试验室保存，均置于10

3、热灭活小牛血清的RPI1640培养液中,在37、52条件下培养。Adnt5a、AdGFP条件培养液的制备Adnt5a、AdGFP由美国芝加哥大学分子肿瘤研究室何通川教授赠送，构建方法见文献4。接种H细胞于6孔板，使集合度达60,分别参加Adnt5a和AdGFP各5l，培养16-48小时检测荧光，根据荧光强度在48-72小时搜集培养液约6l,即为nt5a、GFP条件培养液，-4保存备用。nt5a诱导K562细胞分化实验K562细胞浓度为106/l，于6孔板中，每孔参加2lnt5a、GFP条件培养液、1lK562细胞悬液，培养K562细胞1-7天，每天搜集细胞用于下述实验。K562细胞分化形态学观

4、察分别用nt5a、GFP条件培养液处理K562细胞1-7天，每天搜集细胞，离心后对涂片进展瑞氏染色，在光学显微镜下观察细胞形态变化。处理K562细胞2、5天，搜集细胞离心，用PBS洗涤2次后，2.5戊二醛固定，常规制备电子显微镜检的超薄切片，透射电子显微镜下观察超微构造的变化。nt5a诱导K562细胞分化的细胞化学染色nt5a诱导K562细胞分化时细胞外表分化抗原检测搜集处理1、3、5天的K562细胞，离心涂片进展免疫细胞化学染色，操作步骤严格按照试剂盒说明书进展，D13、D14、D68阳性结果断定：光子显微镜下观察，胞浆中呈棕黄色者为阳性细胞，每例随机选出10个不重复、不重叠的高倍视野104

5、0，计数每个视野的细胞数，计算阳性细胞百分率，结果与GFP组比拟并做统计学处理。nt5a诱导K562细胞分化时细胞周期的变化nt5a、GFP条件培养液分别处理K562细胞1、3、5天，细胞终浓度为1106/l，离心搜集细胞，用PBS洗涤2次，70预冷乙醇固定，RNA酶消化，碘化丙锭PI室温染色30分钟后，上流式细胞仪检测，分析得出处理1、3、5天的K562细胞周期各时相的比例。统计学处理采用SPSS13.0软件进展单因素方差分析，数据以SD表示。结果nt5a诱导K562细胞的形态及超微构造变化光子显微镜下观察，nt5a条件培养液处理5天的K562细胞与对照细胞比拟，显示细胞体积缩小，核浆比减小

6、，核染色质浓缩，核仁减少或消失，有的核出现了凹陷图1，并且出现了个别典型单核细胞形态的细胞图1D。电子显微镜下观察，nt5a处理的细胞的细胞核内异染色质增多，电子密度增大，核仁减小，或变小，胞质增多，核浆比减小，内质网、高尔基体、核糖体、线粒体等明显增多，并随处理时间的延长成熟形态特征更明显图2。nt5a诱导K562细胞分化的细胞化学染色nt5a诱导K562分化时细胞外表抗原标记利用免疫细胞化学染色法检测细胞外表分化抗原D13、D14、D68，并计算阳性率。结果显示：nt5a处理3-5天的K562细胞，单核细胞系外表标志抗原D14、D68阳性率明显高于GFP对照组，统计学分析二者有显著性差异p0.01，粒细胞系外表分化抗原D13表达的增强与对照组比拟无统计学意义p0.05表2。nt5a诱导K562细胞的细胞周期变化K562细胞分别用条件培养液处理5天，GFP处理组细胞的G1期细胞为41.53%，S期为53.19%，G2期为5.27%，这说明K562细胞处于增殖旺盛状态。nt5a处理组细胞G1期为34.47%，S期为48.57%，G2期为16.95%，处理组与对照组K562细胞相比G2期增高了2.22倍，提示nt5a作用5天，能将细胞阻滞在G2期，使细胞不能进展正常的有丝分裂，从而抑制了细胞的增殖表3。讨论总之，结合我们既往的研究及本实验的结果，发现nt