抗生素类药物的分析PPT课件培训

1、抗生素类药物的分析1 概述2 -内酰胺类抗生素3 氨基糖苷类抗生素4 四环素类抗生素5 大环类酯类抗生素原料及制剂（原料）(*/1967）青霉素类36（ 13）10.31.83头孢菌素类44（ 16）12.62.24氨基糖苷类38（14）10.91.93四环素类18（ 6）5.20.92大环内酯类43 （11）12.42.19其他（）169（ 61）48.68.59总计（）348（124）17.69中国药典（2005年版二部）收载抗生素类药物1 概述抗生素？抗菌药物？抗微生物药物？一、概念二、分类按抗菌谱分按化学结构分按作用机制分综合分类三、常规分析项目（一）性状（二）鉴别试验 理化方法、生物

2、学方法。（三）检查 影响产品稳定性的指标 控制杂质的指标 与临床安全性密切相关的指标（四）效价测定（抗生素有效成分含量） 微生物检定法、理化方法效价测定方法微生物检定法以抗生素对微生物的抑制或杀伤程度为指标来衡量抗生素效价理化方法根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质进行测定特点适用于提纯的、化学结构已明确的抗生素。操作简便、省时、方法准确、一定专属性特点灵敏度高；测定原理与临床应用的要求一致；适用范围广. 操作步骤繁多，测定时间长,误差较大.2 -内酰胺类抗生素-内酰胺抗生素的发现 Alexander Fleming 发现接种青霉菌的培养物可产生抑制金黄色葡萄球菌生长的物质

3、，1929年，他在英国圣玛丽医院宣读一篇论文，引入“青霉素”(Penicilin)名称并论述该物质具有非常明确的抗菌活性。1941年临床证实青霉素对多种细菌感染有效。 Fleming 发现青霉素头孢菌素C是Abraham于1948年发现。化学结构与性质鉴别试验化学法、光谱法、色谱法特殊杂质检查聚合物、有关物质和异构体、吸收度含量测定碘量法；硝酸汞电位滴定法；可见-紫外分光光度法；HPLC法基本内容一、化学结构与性质（一）典型药物的结构1. 青霉素族和头孢菌素族基本结构 青霉素族 头孢菌素族 青霉素Penicilins头孢菌素Cephalosporins(1) 强酸性(2)旋光性(3) UV吸收

4、(3) 如有共轭系统则有UV吸收，否则没有（4） -内酰胺环的不稳定性2. 青霉素类和头孢菌素类理化性质-内酰胺环的不稳定性见P313青霉素降解反应（分解、分子重排） 强酸性 中强酸、弱酸 碱性或青霉素酶完全水解 （pH=2）（pH=4） 分子 重排 D-青霉胺 青霉酸 青霉烯酸 青霉噻唑酸 青霉醛 二氧化碳 脱羧青霉噻唑酸 D-青霉胺 青霉醛 金属离子(铅、铜、汞、银); 催化作用 鉴别试验沉淀反应A. 在稀盐酸中生成白色沉淀B. 重氮化-偶合反应或与三硝基苯酚 反应(结晶析出) 光谱法UV、IR、NMR色谱法TLC 、HPLC呈色反应 1.羟肟酸铁反应a.茚三酮反应 b.裴林试剂反应a.重

5、氮苯磺酸 b.变色酸-硫酸c.H2SO4-HNO3 d.铜盐2.类似肽键反应3.其它呈色反应焰色反应(钠、钾盐)二、鉴别试验分光光度法 红外吸收光谱法*-内酰胺类抗生素共有特征峰-内酰胺羰基伸缩振动：1750 1800 cm-1仲酰胺氨基、羰基伸缩振动：3300 cm-1 ，1525 cm-1 ，1680 cm-1 羧酸离子的伸缩振动：1600 cm-1，1410 cm-1供试品的红外吸收光谱 标准对照品图谱紫外分光光度法 max和水解产物的max呈色反应H+FeNH4（SO4）21.羟肟酸铁反应a.茚三酮反应 b.裴林试剂反应2.类似肽键反应(-CONH-, -氨基酸结构）呈色反应a.重氮苯

6、磺酸(-C6H5-OH) b.变色酸-硫酸 c.H2SO4-HNO3 d.铜盐3.其它呈色反应沉淀反应盐(无机盐、有机胺盐性质)1.在稀盐酸中产生沉淀的反应 青霉素钾(钠)盐水溶液 稀盐酸2滴 白色沉淀 (溶于过量盐酸、乙醚、醋酸戊酯、乙醇、氯仿)2.有机胺盐的特殊反应(1)重氮化-偶合反应 普鲁卡因青霉素 红色沉淀(2)与三硝基苯酚的反应 苄星青霉素 + 苦味酸 结晶 重结晶测熔点 （二苄基乙二胺 + 青霉素） （二苄基乙二胺苦味酸盐）色谱法1. 薄层色谱法 青霉素、头孢菌素 TLC 鉴别 结果判定：供试品所显主斑点的颜色和位置应与对照品的主斑点相同2. 高效液相色谱法 在相同实验条件下，用

7、高效液相色谱法分别测定供试品和对照品的色谱图，其主峰的保留时间应一致。三、特殊杂质检查1. 聚合物2.有关物质和异构体3. 吸光度4.有机溶剂5.结晶性1. 聚合物Ch.p2005：青霉素V钾、青霉素钠、青霉素钾、头孢他啶、头孢拉啶、头孢曲松钠、头孢呋辛钠、头孢哌酮钠、头孢唑林钠、头孢噻肟钠等主成分自身对照面积归一化法限量法自身对照外标法原理：分子排阻色谱方法：色谱法：通过与主成分(或标准杂质)峰面积比较（HPLC法）或斑点颜色深浅（TLC法）来控制杂质的量检查方法：2.有关物质和异构体2.有关物质和异构体*头孢呋辛酯 异构体异构体A、异构体B、反式异构体、头孢呋辛酯3-异构体*头孢氨苄有关物

8、质-苯甘氨酸、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7- ADCA）头孢呋辛钠头孢呋辛酯7-ADCA 苯甘氨酸 头孢氨苄 cefalexin色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-0.01mol/L醋酸钠溶液（用冰醋酸调节pH值至5.0）-甲醇（21:55:24）为流动相；检测波长为220nm 测定一定波长处杂质吸收度来控制杂质量3. 吸光度4.有机溶剂氨苄西林纳二氯甲烷（GC法）头孢哌酮钠丙酮（GC法）头孢硫脒残留溶剂（GC法）头孢他啶砒啶（HPLC法）第一法（偏光显微镜法）第二法（X射线粉末衍射法）5.结晶性三、含量测定 Ch.p2005：青霉胺及其制剂：汞量法其它所有-内酰胺类抗生素含量测定

9、均采用HPLC法微生物法Ch.p2005：磺苄西林钠及其制剂理化方法 含量=?(1)碘量法青霉素或头孢菌素 分子不消耗碘,其降解产物消耗碘A. OH-水解B. pH4.5. 温度在24260C(3)UV-Vis法A.硫醇汞盐法B.酸水解法C.羟肟酸比色法 (与羟胺作用,在稀酸或中性溶液中加Fe3+)生成红色络合物,测A(4) HPLC法(2)电位滴定法（汞量法）(青霉素类化合物的碱性水解产物可与Cu2+ 或Hg2+形成稳定的络合物) 。Hg(NO3)2 滴定剂（一）碘量法原理青霉素青霉噻唑二钠第1步第2步青霉噻唑二钠碘量法 讨论(1)操作应严格遵守规定条件 影响因素多 水解条件; 反应温度;

10、缓冲液浓度; 放置时间; 加碘量; 氧化时间(2)与碘作用温度和放置时间 室温不经水解的青霉素分子与碘不起作用, 在38C时能消耗碘 温度不可过高, 否则空白试验失去意义.(3)淀粉指示剂加入时间(4)空白试验目的: 消除供试品中可能存在的降解产物及其它能消耗碘的杂质的干扰.硝酸汞电位滴定法青霉素 碱性条件 水解 青霉噻唑酸 水解 青霉胺 硝酸汞 定量反应 青霉素: 硝酸汞=1:1 （第二个突跃）优点：不需青霉素标准品作对照应用：中国药典（2000年版）收载的青霉素钠、普鲁卡因 青霉素等采用本法测定含量可见紫外分光光度法硫醇汞盐法： 专属性强、快速、准确、易于掌握 青霉素 青霉烯酸硫醇汞盐（m

11、ax=325345nm） （四）高效液相色谱法HPLC： 一法多用 鉴别试验 杂质检查 含量测定3.Aminoglycosides antibiotics链霉胺衍生物：链霉素、布鲁霉素2-脱氧链霉胺衍生物：庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、小诺霉素其它氨基环醇类衍生物：大观霉素氨基环己醇氨基糖(or中性糖）糖苷键氨基糖苷类抗生素一、化学结构和性质链霉素A1 结构庆大霉素主要组分（C组分）：C1、C1a、C2、C2a(1)碱性和溶解性: 多个羟基和碱性基团，显碱性，能与无机酸和有机酸成盐；2 性质(2)旋光性(eg：链霉胍上的强碱性胍基pKa=11.5，葡萄糖胺的甲氨基pKa=7.7)水溶性

12、抗生素(3)稳定性: 酸、碱、光、热等影响(4) 紫外吸收: 胍基230nm链霉素（结构） 庆大霉素(5)其它反应：链霉素的醛基与醛基试剂(半胱胺酸、羟胺等）起反应导致结构破坏 鉴别试验光谱法UV、IR色谱法TLC 、HPLC呈色反应 1.茚三酮反应2.莫利西试验（Molish Test）3.N-甲基葡萄糖胺反应(Elson-Morgan Test)4.麦芽酚反应(Maltol Test)5.坂口反应(Sakaguchi Test)一般鉴别试验硫酸盐反应二、鉴别试验 具有羟基胺和-氨基酸性质，与水合茚三酮蓝紫色缩合物1.茚三酮反应2.莫利西试验（Molish Test）氨基糖苷类抗生素HCl

13、or H2SO4水解脱水羟甲基糠醛（六碳糖）-萘酚 蒽酮糠醛(五碳糖）带色化合物呈色反应3.N-甲基葡萄糖胺反应吡咯衍生物（I ）红色缩合物（II）链霉素水解碱性溶液乙酰丙酮对二甲氨基苯甲醛N-甲基葡萄糖胺4.麦芽酚反应链霉素 碱性溶液 链霉糖分子重排 消除N-甲基葡萄糖胺和链霉胍 麦芽酚（-甲基-羟基-吡喃酮）弱酸性溶液+铁离子紫红色配位化合物链霉素特有反应5.坂口反应链霉素水溶液 NaOH试液水解 链霉胍 次溴酸钠 产物 橙红色化合物 -萘酚 (8-羟基喹啉)次溴酸钠 产物 特有反应 橙红色色谱鉴别(庆大霉素）1.薄层色谱法: 硅胶G 板;氯仿-甲醇-氨溶液(1:1:1)展开剂;碘蒸气显色

14、 结果:供试品与硫酸庆大霉素标准品比较,所显斑点的颜色与位置应一致.2.高效液相色谱法: 根据色谱图中庆大霉素C1、C2、C1a、C2a 和C2b组分的保留时间鉴别。 判定法：供试品溶液所得的各组分色谱峰的保留时间应与对照品溶液色谱峰的保留时间一致。 BP（2005）收载的硫酸庆大霉素采用本法鉴别。光谱鉴别1.紫外分光光度法: 庆大霉素分子中无共轭双键系统 紫外区无吸收 2.红外光谱法三、特殊杂质检查1、链霉素中链霉素B的检查 TLC法2、硫酸奈米替星中有关物质检查 TLC法3、庆大霉素C组分检查 HPLC法4、硫酸盐测定 EDTA滴定法庆大霉素美国Schering公司M.J.Weinstei

15、n 于1963年发现. 临床用硫酸盐. 硫酸庆大霉素在国内于1969年正式投产. 国内各厂的发酵工艺基本一致, 提炼工艺各具特点.各厂产品C 组分含量比例不完全一致,三个主要组分C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差别,但其毒副作用和耐药性有差异. 因此,各组分的比例影响产品的效价和临床疗效,故各国药典均规定控制各组分的相对百分含量. 检测方法衍生化反应：（1）衍生化-紫外检测器测定条件（反相离子对色谱法）填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：水-冰醋酸-甲醇(25570)配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液；检测波长为330nm。色谱条件 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.6

16、5mg的溶液，精密量取4.0ml，置10ml量瓶中，加异丙醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60水浴中加热15分钟，冷却，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取庆大霉素标准品，同法测定。C组分的保留时间依次为：C1、C1a、C2a、C2。测定法计算式（外标归一化法）：Cx为供试品Cx组分的含量； Hx为测定的供试品Cx组分的峰高值； Rx(响应因子)为Hx/Fx； Fx为标准品Cx组分的含量标准值； Hx为测定的标准品Cx组分的峰高值。（3）蒸发光散射检测器（2）电化学检测器微生物检定法HPLC四、含量测定4 Tetracyclines antibio

17、tics殊杂质检查C.AgNO3白色沉淀A.浓H2SO4呈色B. FeCl3呈色D. UV吸收E.荧光法F. TLCG.HPLC含量测定A. 有关物质B. UV法C.残留溶剂A.微生物检定法B. 比色法max440nmC. HPLC法 两性化合物 稳定性A.易氧化B.差向异构化反应C.降解反应D.与金属离子反应 结构特点：具有氢化四骈苯环鉴别试验旋光性紫外吸收和荧光特性差向异构化差向四环素与金属离子形成配位化合物脱水四环素差向脱水四环素浓硫酸FeCl3试液盐酸四环素深紫色红棕色盐酸金霉素蓝色 橄榄绿深褐色盐酸土霉素深朱红色橙褐色盐酸多西环素黄色褐色参见P338表11-45 大环类酯类抗生素 本

18、类抗生素为多官能团的糖苷结构,由大环内酯苷元部分和至少一个糖基组成。吉他霉素 大环内酯类抗生素鉴别试验IR法 硫酸显色 红棕色UV法含量=?杂质检查TLC、HPLC微生物法、TLC、 HPLC、 UV法等Molish反应(糠醛）十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ，0.2 mol/L磷酸铵缓冲液（取磷酸二氢铵1.15g，加水50ml溶解，用三乙胺调节pH值至6.5）- 0.2mol/L四甲基氢氧化铵溶液（取25%四甲基氢氧化铵14.6ml，加水100ml，用磷酸调节pH值至6.5，再加水稀释至200ml）乙腈水（5193244） 吉他霉素十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.1mol/L醋酸铵溶液-甲醇-乙腈（35:60:5）为流动相；柱温60；检测波长为231nm 含量测定微生物检