细胞培养实验

1、真核细胞培养、冻存、计数实验 （上）指导老师：巩丽云 7121一、基本目的了解细胞培养的常规知识和无菌操作的基本原则掌握贴壁细胞的复苏方法；掌握镜下观察贴壁细胞生长状态的方法了解细胞培养的基础知识2二、实验内容 细胞复苏 细胞观察3三、实验材料及仪器1、材料： 人肺癌细胞 细胞培养基（RPMI1640液体培养基,10胎牛血清,双抗100单位/ml） PBS 细胞培养耗材2、仪器： 二氧化碳培养箱 倒置显微镜 生物安全柜 液氮罐 离心机4四、细胞复苏方法（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养基稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分

2、钟；（4）去上清，加新鲜培养基培养刚复苏的细胞。5基本概念细胞系（Cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。细胞株（Cell strain）：通过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。6有限细胞系（finite cell line）：细胞系形成后仅能维持有限传代次数，最后死亡。连续或无限细胞系（ continuous cell line or infinite cell line）：具有无限繁殖能力（获得不死性）和能反复进行传代的细胞系。7细胞培养的优点可长时间监控、检测，定量评估一部分活细胞的情况。研究条件可人为的控制。研究的样本可以

3、达到比较均一性。研究的内容便于观察、检测和记录。研究的范围比较广泛。研究的费用相对较经济。8细胞培养的缺点生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，但仍有很大差异。9培养细胞的形态学方面检测肉眼观察培养基的颜色变化桃红色：正常情况橙黄色: 细胞生长状态良好淡黄色: 培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多紫红色: 细胞没有生长、生长状态不好、或已死亡10相差显微镜观察活细胞细胞生长状态良好：透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡，胞膜清晰。培养上清清澈透明，看不到悬浮的细胞或碎片。细胞生长状态不良：胞质中常出现空泡、脂滴和颗粒物质，细胞形态可变得不规则，甚至失去原来特点。11无菌操作技术（一）实验前的准

4、备根据实验的要求，将所需物品及试剂灭菌消毒。清点所需用品，一并放入超净台内；12（二）无菌室和操作野消毒 实验前，将实验器材放人超净台内，打开超净台紫外线灭菌灯，照射30分钟，关闭紫外线灯，同时起动超净台风机13（三）无菌操作基本要求洗手、着装与外科临床要求相同；手指不能触及器材使用端 ；一切操作都要在火焰周围进行，瓶口要顺风斜放在支架上，试剂使用后立即封闭瓶口；细胞培养各用液要专管专用，并要勤换吸管 瓶口液滴不能再进入瓶内；动作要准确敏捷，尽量避免空气流动；在实验过程中，不要面向操作野讲话或咳嗽。14（四）实验后的要求关闭超净台风机和电源；用过的玻璃器材投入清水中浸泡，包装纸叠卷，绳成束分类

5、归放；最后用酒精纱布或棉球擦拭工作台面。15细胞培养的基本条件无菌条件细胞生长条件细胞检测条件细胞保存条件实验室安全16细胞培养的无菌环境 无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 （使用前）紫外照射（1小时）每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒 17生物安全柜 使用前开启柜内紫外灯照射30分钟，预工作1015分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。还要定期用福尔马林熏蒸。 1819火焰消毒在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近

6、处并经过烧灼进行。培养瓶滴管、试管、吸管20细胞培养的实验用品 细胞培养瓶 25平方厘米，正方斜颈25平方厘米，三角斜颈75平方厘米，正方斜颈75平方厘米，三角斜颈150平方厘米，正方斜颈 21细胞培养板 6孔12孔24孔48孔96孔22细胞培养皿35mm60mm100mm23冻存管1.2ml 2ml5ml24离心管15ml50ml细胞刮25滤 器26液氮罐272829细胞的营养碳水化合物、氨基酸和脂类三大类也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素30细胞培养液 水平衡盐溶液 pH调节液消化液抗生素溶液培养基 31平衡盐溶液主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓

7、冲液： 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）32 pH调节液(1) 碳酸氢钠液 (2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂通常使用浓度为1015mM 33 消化液胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶 (3)胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对

8、象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。 34抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位 35培养基分天然培养基和合成培养基天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） 36合成培养基根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、MEM另有无血清培养基、无蛋白培养基37牛血清胎牛血清应

9、取自剖腹产的胎牛新牛血清取自出生24小时之内的新生牛小牛血清取自出生1030天的小牛使用浓度： 一般为520，最常用是10 38无机盐CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。 39氨基酸 缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成谷氨酰胺具有特殊的作用，补加一定量的谷氨酰胺 。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性 。 40真核细胞培养、冻存、计数实验 （下）指导老师：巩丽云 杨一生物化学和分子

10、生物学教研室 医学院71241传代将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。 HepG2细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞； 培养的天数：传代培养2天； 细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。 42传代注意事项接种数量为51048105个/ml 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行

11、传代。 43体外培养细胞的分型 44贴附型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：成纤维细胞上皮型细胞游走细胞型多型细胞型451、成纤维细胞型名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等 的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状 细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维 样细胞，常有几个伸长的细胞突起46成纤维细胞47 HUVECs人脐静脉内皮细胞1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；2.培养的天数：4d；原代培养；3.放大

12、倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：DMEM+15胎牛 血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。 骨髓间充质干细胞1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；2.培养天数：7天；3.放大倍数：200倍，倒置显微镜；4.培养基种类：DF12+10FBS；5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。 482、上皮型细胞名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中

13、有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动49上皮型细胞50 SKOv3 （卵巢癌细胞）1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养的天数：传代后3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生 长，生长速度较快。 CCL-1491.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；2.培养的天数：1d（种在48孔板中）；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，34天传代一次，Giemsa染色。513、游走细

14、胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 CNE11.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系；2.培养的天数：3d；3.放大倍速：相差100；4.培养基种类：PMI1640+10%CS；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞， 梭型成团生长。 524、多型细胞型有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 SD大鼠神经元 原代1.细胞种类：脑皮质细胞；2.培养的天数：4-5天；3.放大倍速：电镜20000；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清+10%马 血清；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴 突和

15、树突。53悬浮型概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)54 HL-60 分化细胞Giemsa染色1. 细胞种类：HL-60； 2. 培养的天数：ATRA 1微摩尔作用5天；3. 放大倍速：倒置显微镜 X10；4. 培养基种类：1640+8胎牛血清；5. 细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或 消失，胞核呈杆状或分叶状。 55 KU8121.细胞种类：

16、人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。 56 HeLa细胞1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养；2.培养的天数：7d；3.放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。 57 K562细胞1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细

17、胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。 58 每代贴壁细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）59游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性60细胞培养的污染和检测细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞 61 细菌培养液被洋葱佰克霍尔德

18、菌污染了。洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。 62白色念珠菌污染 63真菌感染64支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状 65荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体66Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体67扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体68根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。细胞传代方法6970细胞计数计数结果以每毫升细胞数表示细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数71细胞计数步骤1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。细胞数/ml4大格细胞总数/ 4104注意：压线细胞只计左侧和上方的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个