响应面法优化豆粕中大豆异黄酮的提取工艺设计研究

1、 PAGE7 / NUMPAGES7 响应面法优化豆粕中大豆异黄酮的提取工艺研究阮洪生，葛文中，秦学功，安红波某八一农垦大学生命科技学院 （某 163319）摘要：以豆粕为原料，以染料木素含量为指标通过单因素实验初步得到提取工艺条件，再根据BoxBenhnken的中心组合实验设计原则，在单因素实验的基础上采用3因素3水平的响应面分析法，建立了大豆异黄酮含量与各影响因子的回归方程，并得到以大豆异黄酮含量为响应值的响应面图和等高线图，进而得出豆粕中大豆异黄酮的最佳提取工艺条件：温度78.94、乙醇浓度59.28、乙醇用量为20.85：1、每次提取2h，提取2次。在此条件下，染料木素的理论提取量为1

2、2.03g/g。关键词：响应面法；大豆异黄酮；提取工艺大豆异黄酮是存在于大豆中的生物活性成分，主要来源于豆科植物的荚豆类，其含量最高为0.1%0.5%。目前发现的大豆异黄酮共有12种，分为游离型苷元和结合型糖苷两类1，其药效物质为游离型的染料木素、大豆苷元和黄豆黄素。现代药理学研究表明，除具有抗氧化作用外，大豆异黄酮还可作为雌性激素治疗的替代品，用于改善妇女更年期综合症，并具有降低血液胆固醇、防止骨质疏松及抑制癌细胞生长的作用2。此外，大豆异黄酮还具有防止心血管疾病、抗菌等多种功能，已广泛应用于食品、医药等行业36。本实验立足于我国资源优势，采用脱脂后的豆粕为原料提取其中的大豆异黄酮成分，适应

3、保健食品和医药工业的需要，为大豆的综合利用开辟新的途径。本实验采用脱脂后的豆粕为原料，乙醇水溶液为溶剂，染料木素的含量为指标，根据影响有效成分提取因素，实验中采用响应面分析法(ResponseSurface Analysis)进行设计，该法利用多元二次回归方程拟合因素与指标之间的函数关系，通过对象迎面的等值线分析寻求最优工艺参数。1材料与方法1.1 原料与试剂95%乙醇，某新春化工厂；豆粕，某吉庆豆业某；染料木素（含量测定用，纯度大于99%），某思科华生物技术某；其他试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备TU1800紫外可见分光光度计(普析通用仪器某公司)、恒温水溶锅（某精密科学仪器某）、LD5A

4、离心机（某英泰仪器某）。1.3大豆异黄酮含量测定方法 参考文献方法7采用染料木素为对照品的紫外分光光度法。在260nm处测得吸光度，以对照品微克x为横坐标，以测得的吸光度值y为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，y=0.026+3.748x, r=0.9998。1.4单因素实验选取温度、溶剂浓度、乙醇用量3个可能影响提取效果的因素做单因素实验，以确定相关因素及各因素的合适X围。1.5响应面实验根据单因素实验结果，选择对大豆异黄酮提取效果有影响的因素，实验中采用响应面分析法进行设计, 做温度、溶剂浓度、乙醇用量的3因素3水平共17个实验点(5个中心点)的响应面分析实验,运用SAS RSREG(Re

5、sponse surface regression)程序对17个实验点的响应值进行回归分析。基金项目：某市科研课题豆粕中大豆异黄酮的提取与精制工艺研究（SGG2005-034）。作者简介：阮洪生（1973-），男，硕士，讲师，主要从事中药学的教学和科研工作。2结果与分析2.1 单因素实验2.1.1最佳乙醇浓度的确定称取5克豆粕，提取温度80，乙醇用量201，提取2次，每次2h，分别以50%、60%、70%、80%、95%的乙醇浓度进行提取，按照1.3含量测定条件测定其染料木素含量，结果见表1。表1 不同乙醇浓度的提取情况Table1 Effects of ethanol concentrati

6、on on the soysaponins of soybean residue乙醇浓度（）Ethanol concentration5060708095染料木素（g/g）6.3912.175.706.389.03从表1数据可以看出，随着乙醇浓度的变化，染料木素的含量有一定的变化，但乙醇浓度60%时，染料木素的含量达到最高值，以60%乙醇提取较好。2.1.2最佳提取温度的确定称取5克豆粕，乙醇浓度60%，提取2次，每次2h，乙醇用量201，分别以提取温度50、60、70、80、90进行提取，按照1.3含量测定条件测定其染料木素含量，结果见表2。表2 不同温度的提取情况Table 2 Effec

7、ts of tempreture on the soysaponins of soybean residue提取温度（）tempreture5060708090染料木素（g/g）6.658.149.3911.699.74从表2数据可以看出，随着提取温度的变化，染料木素的含量也有变化，但提取温度80时含量最高，故提取温度确定为80。2.1.3最佳乙醇用量的确定称取5豆粕，乙醇浓度60%，提取温度80，分别以5：1、10：1、15：1、20：1、25：1进行提取，提取2次，每次2h，按照1.3含量测定条件测定其染料木素含量，结果见表3。表3不同物料比的提取情况Table 3 Effects of

8、ratio on the soysaponins of soybean residue乙醇用量（w/v）Ratio1：51：101：151：201：25染料木素（g/g）6.599.0710.6511.819.74从表3数据可以看出，随物料比的变化，染料木素的含量有所变化，但是物料比在1：20时，染料木素的含量最高，故物料比最终确定为1：20。2.2 响应面实验2.2.1 响应面分析法分析因素的选取及实验结果本实验选择温度、溶剂浓度、乙醇用量3个因素，做了3因素3水平共17个实验点(5个中心点)的响应面分析实验。表4为响应面实验设计表，实验数据见表5。表4 提取工艺因素水平表Table 4 L

9、evel values of each factor水 平Level因 素乙醇浓度（%）ethanol concentration(x1)乙醇用量（ w/v）ethanol quantity(x2)提取温度（）temperature(x3)-15015700602080170259017个实验点可分为两类：其一是析因点，自变量取值在各因素所构成的三维顶点，共有14个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计实验误差，以染料木素的提取率为响应值，经回归拟合后，确定函数表达式。表5响应面实验数据方案与结果Table 5experiment designed and the re

10、sults实验号Numberx1x2x3R1（g/g）1-1-106.3366721-106.283333-1107.4300041106.040005-10-17.14667610-16.086677-1017.1900081016.5666790-1-16.786671001-110.19000110-116.37667120117.533331300011.720001400011.820001500011.883331600012.016671700012.296672.2.2模型的建立与显著性检验用Design Expert软件，对表5中的数据进行多元回归拟合，选择对响应值显著的各项

11、，可得乙醇浓度、提取温度()及乙醇用量（w/v）与大豆异黄酮的二次多项回归方程：回归方程为：Y=11.947334-0.390834X1+0.676249X2-0.317918X3-3.199500X12-0.334165X2*X1-2.225334X22+0.109168X3*X1-0.561668X3*X2-2.000332X32对回归方程进行显著性检验、方差分析及各因素最佳点值分析，结果见表6、表7和表8。表6 回归模型系数及其显著性检验表Table 6 Regression coefficient and significance test参数项parameter自由度DF回归系数Co

12、efficient of regression标准误差SEt值TvaluePrtIntercept111.9473340.31792037.58.0001X11-0.3908340.251337-1.560.1639X210.6762490.2513372.690.0311X31-0.3179180.251337-1.260.2464X1*X11-3.1995000.346445-9.24F显著性Significance一次项35.6890790.05653.750.0680*二次项389.7334470.891059.19.0001*交互项31.7562170.01741.160.3908回

13、归和997.1787430.964921.370.0003*失拟项33.3400001.110022.390.0058*纯误差40.2000000.0500误差和73.5375490.505364注：*：P0.10；*：P0.05；*：P0.01；F0.01（9，7）=6.72。Note:*：P0.10；*：P0.05；*：PF0.01（9，7）=6.72，因此因变量与全体自变量之间的线性关系是高度显著的，回归方程的决定系数R2=0.9649,说明模型能解释96.49%响应值的变化，因而回归方程的拟合程度很好。模型预测最大响应值为12.035808。由SAS分析结果可算出各因素的最佳取值，如表

14、8。表8各因素最佳点值分析结果Table 8 analysis result of the different factor因素factor编码Coding理论值（g/g）value乙醇浓度（%）-0.07178659.28214乙醇用量（倍）0.17063220.85316提取温度（）-0.10538178.946192.2.3模型的验证 为了验证豆粕中大豆异黄酮提取模型方程的适用性，在最佳的温度、乙醇浓度、物料比的实验水平上，重复实验5次。从实测值看出，模型预测值与实测值吻合极好。说明用此模型指导实践应具有非常好的效果。2.2.4 响应因素水平的优化由回归方程所作的响应曲面图及其等高线图，

15、见图1-图3。通过该组图即可对任何两因素交互影响豆粕中大豆异黄酮提取的效应进行分析与评价，并从中确定最佳因素水平X围。图1图1乙醇用量与乙醇浓度对大豆异黄酮得率影响的响应面及等高线图Figure 1.Three-dimensional plot and corresponding contour plot of Soybean isoflavones yield at ratio of solvent to material and ethanol concentration图2图2提取温度与乙醇浓度对大豆异黄酮得率影响的响应面及等高线图Figure 2.Three-dimensional p

16、lot and corresponding contour plot of Soybean isoflavones yield at extraction temperature and ethanol concentration图3图3提取温度与乙醇用量对大豆异黄酮得率影响的响应面及等高线图Figure 3.Three-dimensional plot and corresponding contour plot of Soybean isoflavones yield at extraction temperature and ratio of solvent to material3 小

17、结实验中以染料木素含量为指标，将响应面分析法应用于豆粕中大豆异黄酮的提取工艺上，通过对实验结果的分析比较，确定最佳工艺条件为：乙醇浓度为59.28%、提取温度78.94、物料比20.85（w/v），在此条件下大豆异黄酮的理论含量可达12.03（g/g）。由此可见，利用乙醇提取豆粕中大豆异黄酮是一个比较理想的方法，同时实践也证明采用响应面分析法对豆粕中大豆异黄酮的提取工艺进行优化是非常有效的。参考文献1 X洪斌.大豆生物活性物质的开发与应用M.：中国轻工业，2001.2 Song T T， Gendirch S，Murphy P A. Estrogenic activity of glycite

18、in，a soy isoflavoneJ.J. Agric Food Chem.，1999，47：1607-1610.3 唐传核，彭志英.抗过敏以及低过敏食品的研究进展J.食品与发酵工业，2000，26(4)：44-50.4 Tetsu Akiyama，Junko Ishida，et al.Genistein， a Specifi Inhibitor of Tyrosine-specific Protein KinasesJ.The Journal of Biological Chemistry.1987，262（12）：5592-5595.5 韩祖斌，林华，邓思清，等.异黄酮类植物雌性激素依

19、拉芳对骨代谢的作用J.中国骨质疏松杂志.1999，5(3)：47.6 李晓霞，王宏雁，某丽，等.大豆异黄酮、大豆皂甙的提取工艺研究J.中国油脂，2002，27（6）：41-44.7X玉梅，孙学斌，高旭年，等.紫外分光光度法测定大豆总异黄酮的含量J.中国食品卫生杂志，2000，12（4）：7-8.Study on extracting technology of soybean isoflavonesfrom soybean residue with RSARuan Hongsheng, Ge Wenzhong, QIN Xungong, AN Hongbo（Life Science and T

20、echnology College, HLJ August First Land Reclamation University , (Da Qing 163319)Abstract：Using soybean residue as a raw material.The craft was searched with the concentrate of Genistein by single factor tests primarily,then according to the Box-Benhnken center united experimental design principles based on the single factor tests,the method of