干细胞治疗糖尿病国家人类基因组转化医学中心实验室

1、干细胞治疗糖尿病现状与展望国家人类基因组转化医学中心 1内 容1.糖尿病分型、发病机制及治疗现状2.干细胞独特的生物学特性及分类3.干细胞在糖尿病治疗领域的应用4.存在的问题及展望21型糖尿病发病机制遗传环境胰岛素缺乏1型糖尿病自身免疫性抗体产生 细胞破坏廖二元等.内分泌学,2004,1436-143831型糖尿病的特征4遗传（ 细胞缺陷）2型糖尿病发病机制环境因素（肥胖、生活方式等）2型糖尿病胰岛素抵抗胰岛素分泌不足胰岛素相对缺乏廖二元等.内分泌学,2004,1438-144652型糖尿病的特征多于成年尤其是45岁以上起病多数起病缓慢，隐匿血浆胰岛素相对性降低胰岛素的敏感性降低可伴全身肥胖及

2、体脂分布异常 （腹型肥胖）。常有家族史，但遗传因素复杂。6糖尿病的自然病程环境因素病毒感染自身免疫遗传因素环境因素肥胖营养卫生体力活动糖尿病起病 高血糖及相关临床表现 并发症及相关表现视网膜病变肾病变动脉粥样硬化神经病变失明肾功能衰竭心肌梗死卒中截肢（死亡）致残刘新民主编.实用内分泌学（第3版）.人民军医出版社.P1221，图31-11型糖尿病2型糖尿病（晚期）糖尿病前期 糖尿病期 糖尿病并发症期 糖尿病致死 或致残期71.皮下注射胰岛素 1 型及部分2 型 疗效果不理想，难以阻止并发症发生及发展2.植入胰岛细胞或其替代物 已丧失胰岛细胞功能 *供体细胞来源不足 *免疫排斥反应（移植后患者终身

3、服用免疫抑制剂，体内功能性胰岛细胞可能受到胰岛自身免疫反应的攻击，伴促炎性细胞因子的出现、胰岛细胞凋亡率增加） *移植后患者五年内的病情缓解率小于10% 3.干细胞 胰岛细胞替代物 具有极强的自我更新能力和多向分化潜能的细胞治疗现状8干细胞生物医学第二次革命Science 、Time于1999年、2000年、2007年，2008年多次将干细胞技术评为世界十大科学成就之一。9胚胎干细胞iPS干细胞成体干细胞ISSCR关于干细胞定义自我复制多向分化102、替代和修复死亡或损伤的细胞1、干细胞通过血液循环植入， 或直接植入受损的组织3、激发自身体内干细胞来修复干细胞治疗ISSCR关于干细胞技术定义1

4、1干细胞种类iPS 12 (1)胚胎干细胞干细胞根据起源分类(2)成体干细胞具有全能性，能分化为体内所有的组织和器官，如血液细胞、神经细胞、心肌细胞等分化潜能较弱，通常认为新生的干细胞一旦被确定为某种细胞类型，就会受到某些特定编码序列的调控，只能分化成特定的组织细胞。包括胰腺干细胞、造血干细胞和其他种子细胞。13干细胞的功能性分类骨髓间充质细胞神经细胞肌肉脂肪细胞上皮细胞骨髓间充质干细胞心肌细胞1、全能干细胞2、万能干细胞3、多功能干细胞4、单功能干细胞14干细胞移植的生物学特性（1）趋化性（2）归巢性（3）迁移性（4）分化性（5）远合性 （6）抗原性15干细胞移植治疗疾病的原理1、替代和修复

5、死亡和受损伤的细胞2、激活休眠和处于抑制状态的细胞3、旁分泌作用（分泌神经营养因子、抗凋亡因子等）4、免疫调控机制5、促进细胞间电能力、电传导恢复（如间充质干细胞分泌连接蛋白帮助细胞间连接、促进离子通道的开放等）16*来源充足*低毒性(或无毒性) *一次给药，长期有效*自身干细胞移植还可避免产生免疫排斥反应和相关的伦理学争论等。最好的免疫治疗和基因治疗栽体，是各类疾病细胞治疗和基因治疗的首选靶细胞干 细 胞 技 术 的 优 势17成体干细胞治疗糖尿病研究概述具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞MSC具有巨大的体外扩增潜能，易于分离培养，获取方便；

6、在适当的体外微环境的诱导下，具有多向分化潜能。一定数量的MSC通过血管途径迁移到胰腺组织中，并在胰腺组织特定的微环境诱导下分化增殖为胰岛样细胞，替代损伤的胰岛细胞分泌胰岛素；同时MSC 还具有强大的细胞因子分泌和免疫调节功能，使损伤或部分损伤的胰岛细胞修复。 18胰腺干细胞 具有很强的自我更新能力和分化潜能，能诱导分化为含有、和胰岛细胞, 将其移入糖尿病模型鼠后,能够逆转糖尿病病情，从而为治疗型糖尿病提供了新的胰岛资源。W eir 等分离人胰管细胞培养，成功分离出了胰腺干细胞，并将其分化为既含胰管细胞又含胰岛细胞的细胞群，后者能分泌胰岛素，其分泌量随着浓度的增高而增多，用免疫组化等方法证明了这

7、些细胞群含有胰岛的所有细胞类型。美国科学家从尚未发病的糖尿病小鼠的胰岛管中分离出胰岛干细胞，并在体外诱导分化成能产生胰岛素的细胞。移植实验表明，接受移植的糖尿病鼠血糖浓度控制良好，而对照组小鼠则死于糖尿病。这为干细胞治疗糖尿病奠定了实验基础。19S hah 等将胰岛素原基因通过腺病毒转染造血干细胞, 并将这些干细胞静脉注射到糖尿病大鼠中, 使其血糖水平恢复正常，并在多脏器组织中有前胰岛素原基因表达，说明注射前胰岛素原基因转染的造血干细胞可以短期使糖尿病病情好转。 K ang 等将转基因小鼠骨髓移植入糖尿病鼠体内，通过骨髓扩增，有效阻止了糖尿病复发，并从同种基因供体鼠来源的胰岛和造血细胞注入糖尿

8、病鼠，一半的糖尿病鼠好转，因此同种骨髓移植可以治疗自身糖尿病, 而这些骨髓产生细胞能够分化为胰岛功能细胞。造血干细胞20其他种子细胞Blyszczuk 等证实神经干细胞和骨髓干细胞通过化学诱导和转基因的方法形成分泌胰岛素的细胞。B urns 等从胎鼠脑中分离神经干细胞，体外扩增并诱导分化表达前胰岛素原m R N A , 显示了典型的胰腺细胞的功能应答及新陈代谢中葡萄糖依赖性的增加，说明神经干细胞有分化成细胞来治疗糖尿病的潜能。C hen也证实骨髓基质干细胞诱导分化的胰岛样功能细胞能够作为一种新的干细胞治疗方法在临床上治疗糖尿病。Lu 等将人胰岛素基因通过逆转录病毒转染人骨髓间充质干细胞，结果显

9、示这些体外培养的细胞能够稳定的分泌胰岛素，并且持续3 周以上。21干细胞在1型糖尿病中应用22理想的细胞替代物必需具有以下特点: 1. 表达葡萄糖激酶和葡萄糖转运子2 ; 2. 低表达高亲和力的己糖激酶； 3. 表达激素原转换酶PC2 、PC3 ,能将胰岛素原有效地加 工成胰岛素; 4. 能将胰岛素释放入细胞外的分泌系统；综上所述,由干细胞诱导分化的细胞是糖尿病细胞治疗的最佳种子细胞。23目前国内外研究现状 干细胞独特的生物学特性、极强的自我更新能力及多向分化潜能无疑是获得大量胰岛细胞的最佳种子细胞。可极大地解决胰岛细胞来源不足的问题。近几年，胰岛细胞移植治疗糖尿病，使一些人能脱离胰岛素治疗，

10、血糖控制时间达1 年以上。遗憾的是，胰岛细胞移植仍面临两大难题：供者来源不足、严重的免疫排斥反应等。24干细胞治疗糖尿病优势一 干细胞是基因治疗的最理想靶细胞。对于糖尿病患者来说，仅输入足够数量的胰岛细胞并不能达到治疗效果。来源于自体干细胞的胰岛细胞在植入1 型糖尿病患者体内后，仍会受到免疫攻击，而如果采用同种异体的细胞进行移植也同样会遭受免疫排斥反应。对干细胞进行基因修饰,可避免免疫排斥反应的攻击。25干细胞治疗糖尿病优势二 干细胞的另一优势在于其分化的胰岛细胞可以发挥对血糖的生理性调节作用。通过对非细胞(如肝细胞、垂体细胞、成纤维细胞等) 进行基因修饰，虽然可以使它们分泌胰岛素,但这些细胞

11、并不能精确的模拟细胞发挥生理性的调节作用。 26机理探讨一27机理探讨二28机理探讨三29用于临床的干细胞来源自体外周血自体骨髓胎儿附属物（脐血、脐带、羊膜等）30自体骨髓干细胞移植在无菌条件下抽取糖尿病患者自身的骨髓血混合液，通过分离、纯化等过程，将骨髓干细胞定向培养、分化成能够产生胰岛素的细胞，制成含有足够数量干细胞的细胞悬液，再注入患者体内。 自体外周血干细胞移植予以糖尿病患者粒细胞集落刺激因子（G-CSF）注射治疗四五天，以动员细胞产生了某种变化，通过诱发使骨髓干细胞进入外周血，使其在外周血中达到一定数量后，再应用血细胞分离机分离出所需干细胞进行移植。 脐带间充质干细胞移植31脐带间充

12、质干细胞Whartons 胶*在细胞增殖方面优于骨髓干细胞移植，能形成更大的胰岛细胞团块*在表达胰岛特异性标致C肽方面较分化后的骨髓干细胞移植高72%*脐带的组织抗原性较弱，不易被受体的免疫系统所识别 32适 应 证1型或部分2型糖尿病患者。年龄1865岁。糖尿病病程3年以内。应用胰岛素治疗血糖控制尚可者。依从性好。 33干细胞治疗糖尿病疗效判断标准不需要胰岛素维持健康状态。胰岛素的用量减少低血糖发生概率降低。34疗效评价的主要指标观察移植前后胰岛素注射剂量、2、1、 、2 、胰岛自身抗体(、 2、)等变化。35国外干细胞研究现状 * 巴西圣保罗大学治疗15例1型糖尿病患者，结果14例停用胰岛

13、素，虽然其中2例在1年后恢复胰岛素治疗，但胰岛素用量仍显著降低。但这也是目前已知的、全球最大的、随访时间最长的关于干细胞治疗糖尿病的研究数据。 * 2009年4月14日美国医学会杂志（JAMA）发表了一项巴西最新研究结果，新诊断1型糖尿病患者（23例）接受平均29.8周的造血干细胞移植（HSCT）治疗后，C肽水平显著升高，大多数患者成功摆脱了对胰岛素的依赖 36结 果2008-2011年共进行120例糖尿病患者的临床研究，移植前与移植后皮下胰岛素(诺和灵、诺和灵)注射总量平均为56,85%患者于移植后第14日开始减量,移植后第30天胰岛素30。18例病人停用胰岛素，时间超过24个月。37不良反

14、应治疗过程中环磷酰胺处理阶段,患者出现恶心、呕吐等症状,预处理后第5日症状消失。干细胞回输过程未出现发热。38南京鼓楼医院患者男,21岁,因“口干、多饮、多尿伴消瘦周,神志不清3小时”于2006年6月18日入院。 诊断1型糖尿病国内第一例沈山梅李莉蓉周士海冯文焕许景艳欧阳建朱大龙.自体造血干细胞移植治疗1型糖尿病附一例报告. 中国糖尿病杂志2008年第16卷第9期39治疗基本过程(1)干细胞动员:化疗外加粒细胞集落刺激因子( );(2)干细胞采集:采集足量的干细胞,确保34+细胞总量2106/;(3)干细胞冻存:加入细胞冻存液后进行深低温冻存(-80);(4)干细胞预处理方案:选用+;(5)干

15、细胞回输:经静脉回输入体内;(6)支持治疗:预处理1周后予 协助造血重建。40结果移植前与移植后皮下胰岛素(诺和灵、诺和灵)注射总量均为38,于移植后第14日开始减量,移植后第27日停止注射胰岛素。胰岛素停用时间已超过15个月。41随 访血糖控制良好(4 25 7/,27 18 8/);移植后1、5、8、13个月1分别为4 1%、6 9%、5 6%、5 4%, 水平均较移植前明显增加(表1)。移植后第5个月复查、 及 2, 2仍为阳性,其余为阴性。42治疗后的病情进展治疗过程中及治疗后体重稳定,于干细胞预处理阶段,患者出现恶心、呕吐、脱发等症状,预处理后第5日症状消失。于干细胞回输后第8日出现

16、发热(体温38 839 3),5天后体温降至正常。未发生严重的骨髓抑制、出血性膀胱炎、间质性肺炎等。移植后第15日,正常造血功能重建。患者体力已恢复正常。43第三军医大学在西南地区首家采用自体骨髓干细胞胰腺定向移植治疗糖尿病,该患者为接受该方法治疗的第1例。 隆敏,郑宏庭,童强,严俊,段炼,杨阎峙,徐梓辉。自体骨髓干细胞胰腺定向移植治疗糖尿病1例 .第三军医大学学报，2010;32（6）：524.44干细胞治疗方法移植前3d预先皮下注射集落刺激因子动员骨髓。手术当日采取患者400ml骨髓,并立即在层流实验室行骨髓单个核细胞分离,患者入介入手术室,寻找到供应胰腺的胰背动脉后,将骨髓干细胞缓慢均匀

17、注射入胰背动脉。 45结 果 1术后随访发现在空腹血糖6mmol/L、餐后血糖8mmol/L的情况下,术后1月胰岛素泵基础量减少至16U,三餐前各3U,日胰岛素总量减少了39.02%,术后3个月基础量减少至11U,三餐前各2U,日胰岛素总量减少了58.54%,其术后3个月内胰岛素剂量大幅度减少了58.54%,有望完全停用胰岛素46结 果 2复查GHbA1c为7.7%。复查馒头餐试验,血糖分别为7.9、7.61、9.65、17.20、16.13mmol/L;胰岛素分别为2.9、2.22、3.35、10.83、9.52U/ml;C 肽分别为1. 73、1.60、1.84、3.51、4.2ng/ml。 47解放军第455医院景华,陈文怡,李克良,甄二真(解放军第455医院,上海200052).自体造血干细胞回输治疗型糖尿病2例东南国防医药48于4月15日开始皮下注射格拉诺赛特行干细胞动员,4月20日外周血CD34阳性报告为1.72%,行自体外周血造血干细胞采集,过程顺利。口服环孢素A及ATG(20mg/日,连续5天)治疗后,回输自体造血干细胞(具体过程同前)。49出院时复查C肽:空腹1.94ng/ml,餐后2小时2.9ng/ml。回输后20天停用胰岛素,血糖控制在4.55.9mmol/L之间,血像正常。50随访4月,C肽:空腹1.14ng