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文档简介
1、Q/LB.XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由国家粮食和物资储备局提出。本文件由全国粮油标准化技术委员会(SAC/TC 270)归口。本文件起草单位:南京财经大学、南京农业大学、国家粮食和物资储备局科学研究院。本文件主要起草人:都立辉、沈飞、潘磊庆、袁建、万忠民、宋伟、祁智慧、肖营、胡振阳。粮油检验 稻谷霉菌种属鉴定 光谱法范围本文件规定了利用光谱法测定稻谷中的霉菌种属的术语和定义、原理、仪器、扦样和分样、操作步骤、结果表示和重复性、再现性等内容。本文件适用于稻谷中霉菌种属的鉴定,主要包括产黄青霉、镰
2、刀菌、灰绿曲霉、橘灰青霉、亮白曲霉、杂色曲霉、桔青霉、米曲霉等。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 1350 稻谷GB 4789.15 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数GB/T 5491 粮食、油料检验 扦样、分样法GB/T 24895 粮油检验 近红外分析定标模型验证和网络管理与维护通用规则GB/T 26628.1 粮油检验 储粮真菌标准图谱 第1部分:曲霉属术语和定义下列术语和定义适用于本文件。霉菌 mol
3、d一类菌丝体较发达,无较大的子实体,以寄生或腐生方式生存的真菌。图像采集 image acquisition采集样品的图像,并将图像信息转换成系统可识别信息的过程。图像分析 image analysis采用数学方法对采集的图像信息进行分析判定的过程。原理根据不同霉菌在特定光谱区域的吸收特性,采用图像采集和图像分析技术,通过数学模型判定不同的霉菌种类。高光谱法仪器高光谱仪,具有稻谷霉菌种属鉴定软件。测定测试前的准备样品的采集和分样按照GB/T 5491的规定执行。霉菌菌落的获取按照GB 4789.15规定的方法获取,培养时间为3天。按照高光谱仪的说明书要求进行仪器的预热和自检测试。在使用前,用监
4、控样品(已知种属的霉菌样品)对高光谱仪监测一次,同一样品的测定结果与最初的测定结果相比,霉菌种属的判定应完全一致。测试样品的温度应控制在定标模型验证中规定的温度范围内。霉菌样品的测定将待测样品固定放置于高光谱仪中,采集霉菌样品的高光谱图像,记录数据(1 h内的读取数据有效)。不同厂家的高光谱仪界面设置可能不同,应按照仪器使用说明书中规定的方法进行。结果表述为了得到有效的结果,测试结果应在仪器使用的定标模型所覆盖的霉菌种属范围内。2份样品测定结果满足重复性要求时,取测定结果作为检测结果。检测结果在临界值时,应于24 h后进行复检确认,复检方法应执行相关国家标准规定。重复性在同一实验室,由同一操作
5、者使用同一仪器设备,按相同的测试方法,在短时间内对同一试样进行2次独立测试的判别结果应一致,当判别结果出现偏差,应重复以上测定。红外光谱法仪器红外光谱仪,具有稻谷霉菌种属鉴定软件。测定测试前的准备样品的采集和分样按照GB/T 5491的规定执行。霉菌的获取按照GB 4789.15的规定执行。霉菌菌丝和/或孢子的获取从待检测霉菌菌落上刮取。按照红外光谱仪说明书的要求进行仪器的预热和自检测试。按照红外光谱仪的说明制备检测样品。在使用前,用监控样品(已知种属的霉菌样品)对红外光谱仪监测一次,同一样品的测定结果与最初的测定结果相比,霉菌种属的判定应完全一致。测试样品的温度应控制在定标模型验证中规定的温
6、度范围内。霉菌样品的测定将待测样品固定放置于红外光谱仪中,采集霉菌样品的红外光谱图像,记录数据(1 h内的读取数据有效)。不同厂家的红外光谱仪界面设置可能不同,应按照仪器使用说明书中规定的方法进行。结果表述为了得到有效的结果,测试结果应在仪器使用的定标模型所覆盖的霉菌种属范围内。2份样品测定结果误差满足重复性要求时,取测定结果作为检测结果。检测结果在临界值时,应于24 h后进行复检确认,复检方法应执行相关国家标准规定。重复性在同一实验室,由同一操作者使用同一仪器设备,按相同的测试方法,在短时间内对同一试样进行2次独立测试的判别结果应一致,当判别结果出现偏差,应重复以上测定。(规范性)监控样品的
7、制备仪器高光谱仪:符合本文件5.1的要求;红外光谱仪:符合本文件6.1的要求。监控样品的制备取样:选择纯度单一的霉菌,按GB 4789.15的方法获得单一霉菌的菌落。样品的预处理:将单一霉菌的菌落固定到检测仪器上,或按检测仪器要求进行制样。样品的测定:利用高光谱仪或红外光谱仪(A.1)测定样品的霉菌种属。监控样品应至少制备2份,其中一份留作备份。监控样品的保存样品应密封,保存于冰箱冷藏室中。保存期不宜超过3 d。监控样品的使用期限每个监控样品在使用50次之后,或者出现状态改变、被污染之后,应停止使用并重新制备。_中华人民共和国粮食行业标准粮油检验 稻谷霉菌种属鉴定光谱法(征求意见稿)编制说明标
8、准起草组2022年5月粮油检验 稻谷霉菌种属鉴定 光谱法编制说明1. 工作简况(包括任务来源、协作单位、主要工作过程、标准主要起草人及其所做的工作等)1.1 任务来源根据国家粮食和物资储备局办公室关于下达2019年第一批粮食行业标准制修订计划的通知(国粮办2019192号)的文件规定,本标准名称为粮油检验 稻谷霉菌种属鉴定 光谱法,标准的第一起草单位为南京财经大学。1.2 目的及意义民为国基,谷为民命。作为有着14亿人口的大国,确保储粮安全是保障国家长治久安的战略基础。稻谷中的真菌能引起粮食变色、发热、霉烂或产生真菌毒素,是粮油原料收获过程中从田间携带入储粮的不可避免的重要潜在污染物。霉菌作为
9、污染粮食的重要微生物种类,其个体微小,生长繁殖不易发觉,一旦感官发现异常,或当粮堆开始发热时往往已经造成粮食品质的剧烈劣变,尤其一些产毒霉菌如黄曲霉等在粮食中的生长,还会产生对人畜有强烈毒性的真菌毒素,更会造成储粮价值的极大降低。因此,检测和鉴定稻谷中的霉菌污染是提早发现稻谷品质劣变的基础,可为稻谷品质的保持和问题稻谷的及早处置争取时间。随着人们对美好生活需求的提升,检测和控制粮食中的霉菌生长已逐渐成为粮食行业的新需求。在储粮霉菌检测和控制方面,国内的南京财经大学、河南工业大学、中储粮成都粮食储藏科学研究所和国家粮食和物资储备局科学研究院等粮食行业高校和研究所从20世纪80年代开始就进行了部分
10、研究,通过对国内粮食微生物区系调查,采用传统培养结合显微镜镜检等方法基本确定稻谷上的霉菌有41属,117种。其中优势菌31种,常见菌35种,少见菌49种。GB 4789.15-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数规定了食品中霉菌污染载量的计数方法,但该标准对于污染的具体霉菌种类没有鉴定,后续仍需要专业的技术人员进行进一步鉴定。GB/T 26628.1-2011粮油检验 储粮真菌标准图谱 第1部分:曲霉属规定了储粮中多种曲霉的标准图谱鉴定方法,但该方法需要将储粮霉菌挑取菌丝和孢子,并放置在显微镜下进行观察,并与标准图片进行比对才能获知污染的曲霉种类,且没有涉及青霉菌的鉴定。
11、与本标准同时获批的粮油检验 储粮真菌标准图谱 青霉属虽然进一步将青霉菌的鉴定进行了规定,但仍然采用的是基于显微镜镜检的方法,这些方法具有准确性高,干扰小等优点,但对样品的前处理要求高,且培养过程耗时很长。因此,不太适用于粮食行业尽早发现储粮霉菌污染的现状。高光谱、红外光谱技术是基于对样品的光谱扫描的基础上,对获得的光谱图像进行处理以提取特征谱区进行分类鉴别的方法,在传统霉菌鉴定方法培养和分离的基础上,避免了显微镜下镜检并与标准图谱比对的过程,耗时短,可极大的缩短检测时间,为问题粮处置争取宝贵时间。如传统培养法鉴定霉菌最少需要7天时间,而本法对霉菌的鉴定可以缩短到3天,因此极具应用价值,对保证我
12、国的储粮安全具有重要意义。本标准旨在建立稻谷储粮中霉菌种属的光谱法鉴定技术,用于粮食中霉菌的快速检测和鉴定。便于基层粮库、粮油企业和粮食监管部门对粮食中污染的霉菌进行种属鉴定,便于掌握粮食中霉菌污染状况,防止霉菌污染造成粮食品质劣变,保障粮食质量安全和人民群众身体健康。1.3 协作单位协作单位为南京农业大学、国家粮食和物资储备局科学研究院等。1.4 主要工作过程起草阶段(1)2019年6月-2019年12月,成立标准起草组,查询了国内外资料,对相关检测机构、粮库、粮食加工企业进行了调研,并召开了第一次标准起草讨论会,确定了标准制订方案和工作计划。(2)2020年1月-2020年12月,在南京财
13、经大学食品学院实验室进行标准的研制工作,主要包括典型储粮霉菌光谱图谱的采集、图谱信息的提取、相应鉴定方法和模型的建立、方法准确性测试、方法的重复性确定等研究。(3)2021年1月至2021年2月,编写了粮油检验 稻谷霉菌种属鉴定 光谱法标准草案及编制说明。(4)2021年1月-2021年5月,组织了实验室间的方法验证。验证结果处理统计,并形成粮油检验 稻谷霉菌种属鉴定 光谱法标准征求意见稿及编制说明征求意见稿。征求意见阶段2021年6月,由起草单位通过发函的形式在行业内部征求意见,共发出11份,收回5份,共计10条意见,全部采纳,主要涉及格式以及文本的规范性等问题,未收到重大分歧意见;现已按照
14、反馈意见修改。1.5 主要起草人及其所做工作主要起草人都立辉全程主导了草案编制过程,经过技术调研,咨询,收集和研究有关资料,结合市场需求、行业现状、专家意见等情况撰写了粮油检验 稻谷霉菌种属鉴定 光谱法标准草案,和肖营、胡振阳等完成了标准的主要实验,沈飞建立并优化了标准实验方法,其他起草人袁建、宋伟、万忠民等对草案提出了宝贵的修改意见和建议,祁智慧对标准文本的格式等方面提出建议,潘磊庆协助对标准文本及编制说明的数据进行整理及验证,并协助起草单位之间的联系和沟通,有力地推动了草案编制工作。2标准编制原则和确定标准主要内容(如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等)的论据(包括试验、
15、统计数据)2.1 标准编制原则本标准编制过程中贯彻的总体原则是:生物特性为本,多学科交叉推动粮油质检行业的发展,通过缩短检测时间保障我国粮油食品质量安全。本标准在制订过程中遵循“科学性、适用性、规范性”的原则。本标准的结构、技术要素和表述方法按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则编写,并参考了GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第4部分:试验方法标准的规定进行编制。2.2 标准主要内容2.2.1 标准的适用范围本标准规定了光谱法鉴定稻谷中霉菌种属的原理、材料、仪器及设备、样品制备、样品测定、结果表述和重复性。本标准适用于稻谷等粮食中霉菌种
16、属的鉴定。霉菌的种属主要包括:产黄青霉、镰刀菌、灰绿曲霉、橘灰青霉、亮白曲霉、杂色曲霉、桔青霉、米曲霉等。2.2.2 规范性引用文件依据本标准编写内容的需要,按照标准编制原则,规定了本标准的规范性引用文件:GB 1350-2009 稻谷GB/T 24895 粮油检验 近红外分析定标模型验证和网络管理与维护通用规则GB/T 26628.1 粮油检验 储粮真菌标准图谱 第1部分:曲霉属GB 4789.15 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数GB/T 5491 粮食、油料检验 扦样、分样法2.2.3 术语和定义通过参考国际、国内的相关标准,本标准对霉菌、图像采集、图像分析的定义及术语
17、等进行了描述。2.2.4 标准研制的总体思路(1)不同霉菌用于鉴定的培养时间确定稻谷按GB/T 5491的规定进行扦样和分样后,按照GB 4789.15的要求分离获得霉菌单一纯菌,将单一纯菌接种至相应固体培养基上制备用于检测和鉴定的单一霉菌菌落。如图1所示,不同培养时间下,单一霉菌的生长菌落差异明显,当培养时间为5天时,所有霉菌均可通过光谱法进行准确鉴定;培养时间为3天时,所选择霉菌的光谱法鉴定准确率仍达到90%以上,为保证检测的时效性,选取霉菌的培养时间为3天。图1不同霉菌在不同培养时间的菌落形态(从左至右依次为镰刀菌、曲霉、青霉)(2)光谱法采集霉菌特征的方法确定对于霉菌菌落的高光谱特征采
18、集,采用图2所示的图像采集装置,采用高光谱图像检测系统的反射模式对真菌菌落进行检测,有效波长范围为400-1000 nm。实验参数为:相机镜头和线光源距离样本分别为30 cm和20.5 cm,光照强度为30 W、以45对准样本,曝光时间为2.5 ms,输送速度为2.4 mm/sec。分别用全黑和全白板获得高光谱图像,对样品高光谱图像进行校正处理。图2霉菌菌落的高光谱特征采集平台运用FT-MIR仪,结合ZnSe衰减全反射附件(ATR)采集6种霉菌孢子悬浮液的光谱信息。先以空气为背景进行扫描,将样品用WH-2微型旋涡混合仪混合均匀后(由于FT-MIR仪所用样品量较少,因此尽量使样品均匀,以减少取样
19、带来的误差),移取4 uL的样品于ATR附件上,每个样品分成5份,每份扫描4次。光谱范围为4000-600 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描次数为64次。对于没有ATR附件的红外光谱仪,采用仪器规定的压片方法制片,将霉菌样品干燥后检测。图像采集结果如图3所示。采用FT-NIR仪对污染霉菌的稻谷样品进行检测。称取8 g样品于样品瓶中,待仪器开机30 min后,将样品瓶置于检测器上,对样品进行检测。检测过程中尽量将样品混合均匀,每个样品分成5份,每份检测4次。光谱范围12000-4000 cm-1,分辨率为16 cm-1,扫描次数为64次。图3 不同霉菌样品的FT-MIR光谱图(3)光谱图像的
20、处理图像处理的技术路线如下:图4 图像处理流程图图5 五种霉菌的图像处理流程示意图(4)光谱图像特征的提取经过研究,根据霉菌菌落的形态,将霉菌菌落的特征从颜色、形态和纹理等几个层次进行提取。其中,颜色特征(6种):通过观察真菌菌落的表面颜色的差异,确定了描述颜色特征的六个分量,红色分量R、绿色分量G、蓝色分量B、亮度Y、色度U、V平均值作为真菌菌落图像的颜色特征。形态特征(4种):不同真菌在生长过程中生长速度不同,所形成的菌落大小也有差异,所以根据不同菌种的菌落形态可以确定提取的特征有菌落面积(S)、周长L、外界矩形高度H和宽W。纹理特征(256个):纹理特征是表述图像的一个非常重要的视觉特征
21、,纹理结构反映了图像亮度的空间变化情况,具有局部与整体的自相似性,纹理是由纹理基元按某种确定性的规律或某种统计规律排列组成的,在纹理区域内各部分具有大致相同的结果。本次研究所采用描述纹理特征的算法是局部二进制模式(LBP),LBP最早是作为一种有效的纹理描述算子提出的,由于其对图像局部纹理特征的卓越描绘能力而获得了十分广泛的应用。(5)光谱数据处理方法的确定对于霉菌菌落的高光谱图像识别,采用支持向量机(Support vector machines, SVM)、偏最小二乘法判别分析(Partial Least Squares Discirminant Analysis, PLSDA)、线性判别
22、器(Linear Discriminant Analysis,LDA)和随机森林分类(Random Froest,RF)几种方法进行光谱模型的识别。由表1可以看出,利用四种模型对真菌菌落颜色特征进行分类时,非线性模型SVM、RF在建模集和预测集准确度都要远高于线性模型LDA、PLSDA。线性判别的两种模型中,LDA模型要略优于PLSDA,其中LDA基于颜色的建模集准确率在56.2%-76.6%之间,预测集准确率在58.8%-74%之间。PLSDA建模集准确率在47.1%-55.5%之间,预测集准确率在47.6%-52.8%之间。其中第二天准确率最低,第三天和第四天准确率差别不大。总体上看二者在
23、基于颜色特征分类预测准确率都不高。表1 基于颜色特征的分类结果基于非线性判别的两种模型中,SVM和RF模型表现出较高的准确率。其中SVM建模集准确率在95.7%-99.3%之间,预测集准确率在84%-97.2%之间。RF建模集准确率在三天中都高达100%,预测集准确率在87.6%-92.4%之间。其中第四天的准确率最高,因为随着真菌培养时间的增加,菌落表面的颜色差异越来越明显。SVM在建模集的准确率上略低于RF模型,但在预测集上要稍高于RF模型。总体上二者在基于颜色特征对五种真菌分类预测准确率方面相较于LDA、PLSDA都表现出极大的优势。这说明:颜色在基于真菌菌落特征分类中起到重要作用。由表
24、2可以得出以下结果,LDA在基于形态特征的建模集准确率在47.9%-74.4%之间,预测集准确率在43.6%-71.6%之间。PLSDA在基于形态特征的建模集准确率在50.9%-66.3%之间,预测集准确率在51.6%-64.4%之间;SVM在基于形态特征的建模集准确率在86.6%-89.4%之间,预测集准确率在79.2%-84.4%之间。RF在基于形态特征的建模集准确率在99.3%-99.8%之间,预测集准确率在74.4%-86%之间。表2 基于形态特征的分类结果表3 基于纹理特征的分类结果由表3可以得出以下结果。LDA在基于纹理特征的建模集准确率在76.5%-86.6%之间,预测集准确率在
25、72.8%-81.6%之间。PLSDA在基于纹理特征的建模集准确率在75.3%-88.4%之间,预测集准确率在70%-88%之间。SVM在基于纹理特征的建模集准确率在99.3%-100%之间,预测集准确率在86.4%-95.2%之间。RF在基于纹理特征的建模集准确率在99.9%-100%之间,预测集准确率在82%-90.8%之间。通过结果分析可知,线性模型LDA、PLSDA在以纹理特征作为分类预测数据的准确率要高于颜色和形态特征,且准确率有很大的提高;非线性模型RF、SVM在以纹理特征作为分类预测数据的准确率要高于形态,但是和颜色特征的准确率相差不大,其中虽然SVM在建模集准确率上稍低于RF,
26、但在预测能力上要高于RF。表4 全特征分类结果基于全特征分类时,由表4可得出如下结果,LDA在基于全特征的建模集准确率在91.4%-96.8%之间,预测集准确率在91.2%-95.2%之间。PLSDA在基于全特征的建模集准确率在83%-95.9%之间,预测集准确率在80.4%-92.4%之间。SVM在基于全特征的建模集准确率为100%,预测集准确率在93.2%-97.6%之间。RF在基于全特征的建模集准确率为100%,预测集准确率在91.2%-96.4%之间。其中LDA、PLSDA两种模型的准确率都有很大的提高。结果说明基于全特征分类预测结果要优于基于单一的颜色、形态和纹理特征的结果。对于霉菌
27、的红外检测数据,分别选择两个特征波段提取主成分进行得分图区分,结果如图6、图7所示。图6 霉菌样品的PCA得分图(1800-900 cm-1)图7 霉菌样品的PCA得分图(1800-1485 cm-1)由图6、7可知,图6和图7霉菌的分离趋势大体一致,但图6的霉菌分离效果要优于图7,说明1800-1485 cm-1的波段可代表大部分1800-900 cm-1波段霉菌的特征信息,但不能代表全部。仔细观察图可知,从菌属来看,图6除尖孢镰刀菌Pr靠近亮白曲霉外,不同菌属之间有较为明显的分离趋势;而图7不同菌属的分离趋势显然比图6弱一些,在图7中,部分尖孢镰刀菌Pr与亮白曲霉发生了重叠,其他菌属之间有
28、明显的区分。再从6种霉菌样品之间的聚类趋势来看,图6中亮白曲霉和灰绿曲霉发生了部分重叠,其他菌种有很好的区分;图7中尖孢镰刀菌Pr与亮白曲霉发生了部分重叠,其他菌种分离效果较好。结果表明,PCA可以根据不同霉菌样品红外光谱吸收强度的不同,将不同霉菌进行区分,采用FT-MIR对稻谷中不同霉菌进行快速检测具有可行性。表5 几种霉菌样品的LDA模型留一交互验证结果(1800-900 cm-1)类别预测类别正确率(%)产黄青霉M31有毒镰刀菌灰绿曲霉3.3975尖孢镰刀菌Pr橘灰青霉Pp亮白曲霉产黄青霉M312000000100.0有毒镰刀菌0200000100.0灰绿曲霉3.397500200001
29、00.0尖孢镰刀菌Pr0002000100.0橘灰青霉Pp0000200100.0亮白曲霉0000020100.0总计100.0通过将红外数据进行留一交互验证,结果如表5所示,由表5可知对于选择的几种霉菌而言,红外数据检测数据的整体判别正确率为100%,说明该模型的可靠性非常高。(6)方法的准确度和实际样品分析采用本方法对污染不同霉菌样品的稻谷进行检测,通过留一交互验证实验检测本方法的准确度,并确定实际样品分析的效果,结果如表6所示。表6 污染不同霉菌稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(1800-900 cm-1)类别预测类别正确率(%)亮白曲霉灰绿曲霉3.3975产黄青霉M31有毒镰刀菌橘
30、灰青霉Pp尖孢镰刀菌Pr亮白曲霉145000170.0灰绿曲霉3.3975613000165.0产黄青霉M31001802090.0有毒镰刀菌0002000100.0橘灰青霉Pp001019095.0尖孢镰刀菌Pr030001785.0总计84.2由表6可知,污染亮白曲霉的样品中有5个样品被误判为污染灰绿曲霉3.3975样品,1个样品被误判为污染尖孢镰刀菌Pr样品;污染灰绿曲霉3.3975样品中有6个被误判为污染亮白曲霉样品,1个被误判为污染尖孢镰刀菌Pr样品,说明灰绿曲霉和亮白曲霉有一定的相似性。除污染上述两个霉菌样品外,其余污染霉菌样品判别正确率均大于80%,整体判别率为84.2%,总体判定结果低于纯霉菌样品相应波段的判别正确率。当将红外检测的波段扩展到近红外波段时,人工污染霉菌的稻谷样品的准确度进一步提高,结果如表7所示。表7 污染不同霉菌稻谷样品的LDA模型留一交互验证结果(10000-4000 cm-1)类别预测类别正确率(%)亮白曲霉灰绿曲霉3.3975尖孢镰刀菌Pr产黄青霉M31有毒镰刀菌橘灰青霉Pp亮白曲霉182000090.0灰绿曲霉3.39750200000100.0尖孢镰刀菌
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