动物细胞的融合与单克隆抗体上课

1、植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合杂合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞脱分化再分化愈伤组织杂种植株:植物体细胞杂交过程1植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合杂合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞细胞分裂分化发育愈伤组织杂种植株1、动物细胞融合的概念是什么？ 2、动植物细胞在结构上有何区别？这对它们杂交或融合过程有什么影响？ 3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？那动物细胞融合呢？4、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？是什么原理？5、动物细胞融合有什么意义？主要应用在哪些方面？6、植物体细胞杂交可得

2、到杂种植株，动物细胞融合后能象电影上一样形成杂种动物个体吗?为什么？动物细胞A动物细胞B诱导、融合杂合的细胞有丝分裂2个完整的杂交细胞AB2一、动物细胞融合1.细胞融合： 是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的过程。自然发生： 受精卵 3鼠细胞人细胞人工诱导动物细胞融合杂交细胞人工诱导：利用诱导剂诱导动物细胞融合诱导因素：聚乙二醇、灭活的病毒或电激等。 4仙台病毒紫外线灭活丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）什么是病毒的灭活？ 灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋

3、白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。5灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂交细胞（细胞膜具有一定的流动性）6物理法的融合效率较高,且对细胞（原生质体）的伤害小,易操作、控制和观察。太空中处于失重状态，不同种细胞（原生质体）更容易亲近；为什么在太空中细胞（原生质体）融合率会大大上升？为什么选用物理法诱导？7正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞 正在融合的鸡血细胞动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性8细胞膜的流动性灭活病毒、PEG、电激等融合后的细胞进行有丝分裂，形成完整的杂交细胞诱导的手段:融合后细胞的类型:

4、AB杂种细胞遗传物质有什么特点？三种AA、AB、BB（A、B）含两种生物的遗传物质动物细胞融合过程原理:92、动物细胞融合的应用1.突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。鼠鸡、鼠兔、鼠猴、人鼠、人兔、人鸡、人蛙、酵母菌鸡 、人胡萝卜等3、重要用途：制备单克隆抗体。10获得杂种植株物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电激）化学（聚乙二醇）直接诱导细胞融合去壁原生质体融合诱导新壁杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性结果诱导方法步骤融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物、动物细胞融合的比较获得杂交细胞小结

5、111【例1】能使动物细胞融合的特有的诱导因子是 （ ）A.离心 B.灭活的病毒 C.电刺激 D.振动【例2】融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（ ）具有原来两个或多个细胞的遗传信息 B.能无限增殖 C.可形成新个体 D.培养过程会贴壁【例3】动物细胞融合的作用中最重要的是（ ）A.克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体 C.培育新物种 D.生产杂种细胞 BB初试牛刀A12使用相应的抗体检测乙肝病毒抗原二、单克隆抗体的制备 医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式图 凡能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原。1、什么是抗原？ 例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成

6、为抗原，如癌细胞等。13抗原决定簇：抗原表面具有的某些特定的化学基团，能决定抗原特异性，是免疫细胞识别抗原的重要依据。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的14 2、什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里?起何作用？ 当机体受到抗原刺激剂后由效应B细胞（浆细胞）产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白抗体。 抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液中。15抗体与相应抗原特异性结合163、抗体的传统生产方法：从血清中分离抗体多种浆细胞动物体内多种抗体抗原 17血清抗体（也称多克隆抗体） 由血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆抗体(抗

7、原通常是由多个抗原决定簇组成的,只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群产生的特异性抗体叫做单克隆抗体)。特点： 产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。抗原不纯抗体不纯 抗原 动物体内刺激效应B 抗体18 每一个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，特异性强的抗体。 如果利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体单克隆抗体。问题： 怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？19在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？ 肿瘤细胞！20 5.技术思路的重点杂交瘤细胞 HAT筛选McAb大量培

8、养PEG诱导细胞融合免 疫B 脾矿物油骨髓瘤瘤 问题: 在培养体系中, 有5种细胞. B细胞、瘤细胞,和杂交细胞。 我们还是拿不到McAb,怎么办? 筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛? 又是一个思路问题。 关键一步21如何诱导融合？ 加入聚乙二醇（PEG）如何得到B淋巴细胞？6.制备单克隆抗体的过程22细胞两两融合后，有哪些类型？B-B B-瘤(杂交瘤细胞) 瘤-瘤 如何筛选出杂交瘤细胞？ 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞23细胞合成DNA有D和S两条途径，其中

9、D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。 鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。 你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？ 小资料：24 在培养液中加入氨基喋呤，收集增殖细胞！ 加入氨基喋呤后，使 D 合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成DNA而增殖。25注射抗原效应B细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基 筛选1抗原-抗体杂交法克隆化单克隆抗体 筛选24.第一次筛选出的杂交瘤细胞为何需进行克隆化培养和专一抗体检测？26 通

10、常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞27阳性孔方法抗原-抗体杂交法 在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。2829单克隆抗体筛选杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内细胞培养筛选骨髓瘤细胞诱导细胞融合特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系提取经过免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术单克隆抗体的制备过程：特点：既能产生专一抗体又能大量繁

11、殖特点：特异性强灵敏度高可大量制备注射抗原免疫30单克隆抗体的制备1、怎样获得能分泌专一抗体的B淋巴细胞？2、从何处获得较多的B淋巴细胞？3、用什么方法可以使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？4、怎样筛选出杂交瘤细胞？5、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？6、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？7、怎样获得大量的单一抗体？反复注射特定的抗原，免疫小鼠。小鼠的脾脏PEG、灭活的病毒等利用HAT选择培养基培养，筛选否用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测呈阳性反应体内或体外大量培养特异的杂交瘤细胞，从中提取单一抗体。31单克隆抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合

12、选择培养杂交瘤细胞克隆化培养抗体检测产生所需抗体的杂交瘤细胞体外培养小鼠腹腔内增殖单克隆抗体多种杂交细胞1、该过程中用到了两种技术小结2单克隆抗体的制备过程：动物细胞培养技术动物细胞融合技术2、单克隆抗体的制备过程的三个“一”：一种诱导细胞融合的新方法，产生了一种新细胞，得到了一种优势抗体。灭活病毒诱导融合杂交瘤细胞单克隆抗体优势：特异性强、灵敏度高，可大量制备327、单抗隆抗体的应用作为诊断试剂定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病 用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物 利用同位素标记单抗，在特定组织成像 制成生物导弹，将

13、药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。3334结合同位素的单抗-生物导弹单抗放射性同位素35项目动物细胞融合植物体细胞杂交原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性和植物细胞的全能性融合前提分散成单个细胞去除细胞壁诱导方法聚乙二醇、离心、振动、电激、灭活病毒聚乙二醇、离心、振动、电激、结果获得杂种细胞或细胞产物获得杂种植株用途制备单克隆抗体培育作物新品种意义使远缘杂交成为可能克服远缘杂交障碍36对比比较项目植物体细胞杂交单克隆抗体的制备原理融合前处理促融方法用途过程第一步第二步第三步第四步细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞

14、膜的流动性、细胞增殖酶解法去壁小鼠要免疫处理物理法化学法物理、化学、生物法原生质体的制备融合亲本细胞的准备原生质体的融合与筛选动物细胞融合与两次筛选杂种细胞的形成与培养对产生特定抗体的杂交瘤细胞培养杂种植株的鉴定单克隆抗体的分离提纯单抗有助于疾病的诊断、治疗 获得具优良性状的杂种植株37图中B为_过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能_,又能_ 。B体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群注射到小鼠腹腔AC 1.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案该实验方案的目是 ；A是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生 ；制备单克隆抗体B细胞专一抗体细胞融

15、合灭活病毒双亲细胞分泌专一抗体无限增殖381975年Kohler和Milstein的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，图10示单克隆抗体制备流程阶段示意图。请据图回答下列问题：图10（1）该技术是在动物细胞培养技术和 技术的基础上发展起来的。（2）图10中细胞A体外培养不具有分裂能力，但能分泌 ，细胞B体外培养能够 。（3）动物细胞融合常用的方法是 。图10（1）动物细胞融合（2）分泌特异性抗体 、无限增殖（3）PEG（灭活的病毒、电刺激）39（4）细胞融合是随机的过程，在HAT培养基中培养，要筛选出 细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，常向培养液中加入 （激素）。

16、（5）培养2周后，即测定培养细胞的特征，筛选出 细胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到710个细胞/ml，每孔滴入0.1ml细胞稀释液，其目的是 。（6）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行 培养。（4）杂交瘤、胰岛素（5）特异性分泌抗X蛋白抗体的、保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）、（6）体外或体内40知识拓展3.为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 41知识拓展4.如何