分子生物学：第五章 蛋白质结构与功能-转录因子

1、第 五 章蛋白质结构与功能转录因子 目 录引 言第一节 转录因子的结构第二节 转录因子的作用特点及其研究方法第三节 一些常见的植物转录因子 第四节 动物中的转录因子MyoD 第五节 热休克转录因子HSF 第六节 一些转录因子的实例第七节 人工转录因子 引 言转录因子是细胞内一类重要的基因表达调控蛋白质，它通过与基因上游启动子区中特异的DNA序列的相互作用，来决定被调控基因的开启和关闭以及表达量。一个转录因子可调控数百个基因的表达，而一个基因的表达又可受数个转录因子的调控。转录因子水平的轻微变化，即会对细胞功能产生重大影响。 引 言转录因子的结构和功能缺陷，与人类的一些疾病（如肿瘤和炎症）相关；

2、许多转录因子还是药物作用的靶点。所以，转录因子活性的检测对疾病的研究和药物开发都具有非常重要的意义。人工转录因子的研究和开发，将在基础研究、肿瘤等疾病的基因治疗以及抗病毒治疗等领域开辟一个崭新的途径。 第一节 转录因子的结构 转录因子（Transcription Factor，TF），也称反式作用因子，是指那些具有同真核生物启动子特定DNA序列结合活性的蛋白质分子，或者是具有已知DNA结合域结构特征的蛋白质分子。通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。第一节 转录因子的结构转录因子一般含有4个功能区：DNA结合域、转录调控域（包括激活和抑制域）、核定位信号以及寡聚化位点。

3、但是，不同的转录因子可能缺少某一结构域（如转录调控域或特异的DNA结合域）。转录因子通过这些功能区域，在特定的时间进入细胞核内，与启动子顺式作用元件或与其它转录因子的功能区域相互作用，来调控基因的转录及表达。第一节 转录因子的结构一、转录因子常见的基本结构二、转录因子的种类一、转录因子常见的基本结构 转录因子有一个共同的特性，即由不同的功能结构域组成可调变的蛋白质结构，而这些功能结构域从蛋白总体分离出来后，无论是单独作用还是与其它来源的蛋白连接后，仍保持原有的功能。一、转录因子常见的基本结构1、DNA结合域2、转录调控域3、核定位信号4、寡聚化位点1、DNA结合域DNA结合域，是指转录因子识别

4、顺式作用元件，并与之结合的一段氨基酸序列。通常由60100个氨基酸残基组成。在相同类型的转录因子中，DNA结合域氨基酸序列较为保守。DNA与蛋白质之间的相互识别，取决于DNA碱基对的外缘和氨基酸侧链之间的相互作用。在DNA双链中，互补碱基的外缘暴露于双螺旋结构外侧，形成具有氢键供体和氢键受体的复杂结构。这种结构可以被氨基酸侧链所识别，并且是DNA-蛋白质之间进行特异性识别所必需的。1、DNA结合域DNA结合域带共性的结构主要有以下几种： HTH和HLH结构：-螺旋可与DNA的沟槽相互作用。 锌指结构：见于TF IIIA和类固醇激素受体中。锌指上的碱性氨基酸与DNA的磷酸基有相互作用。锌指结构家

5、族的蛋白又可分为锌指、锌纽、锌簇三类。 几种锌指结构 1、DNA结合域 Leu-拉链结构：见于真核生物DNA结合蛋白的C端。两条肽链呈钳状与DNA相结合；拉链两侧的碱性氨基酸与DNA的磷酸基有相互作用。有的转录因子含有多个DNA结合结构域。转录因子DNA结合域的特定氨基酸序列，决定了它们与顺式作用元件识别及结合的特异性。 Leu-拉链结构与DNA结合2、转录调控域同一家族转录因子的主要区别在于：它们的转录调控结构域各不相同。转录调控结构域可以分为两种： 转录激活域（transcription activation domain） 转录抑制域（transcription repression d

6、omain）它们决定了转录因子功能的差异。 2、转录调控域该结构域常见有4种特征类型： 富含酸性氨基酸； 富含脯氨酸； 富含谷氨酰胺； 富含丝氨酸/苏氨酸。有的转录因子可同时具有几个激活结构域，这些结构域可能是转录因子与其它蛋白质接触作用的区域。 3、核定位信号核定位信号（NLS），是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域，转录因子进入细胞核的过程受该区域的调控。不同转录因子的核定位信号序列、所处的位置、数量有所不同。有些转录因子进入细胞核的过程，是通过1至数个核定位信号进行的；而没有NLS区的转录因子则借助于与具有NLS区的转录因子相互作用进入细胞核。4、寡聚化位点寡聚化位点，是不同转

7、录因子借以发生相互作用的功能区域。它们的氨基酸序列很保守，大多与DNA结合域相连，并形成一定的空间构象。不同转录因子通过寡聚化位点发生相互作用，形成异源或同源寡聚化物，以影响其DNA结合特异性、结合能力以及在细胞核内的定位。 二、转录因子的种类 各种不同的转录因子，依据它们所具有的特殊的DNA结合模式而分成不同的大家族。因为许多转录因子可形成同二聚体和异二聚体，所以各大家族据此可进一步细分成亚家族。正是由于许多转录因子能异二聚体化，从而极大地增加了转录调节的多样性和特异性。 二、转录因子的种类在真核生物中，基因的转录起始涉及两类转录因子： 一般性转录因子（general transcripti

8、on factor，非特异性转录因子或基本转录因子）：是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组因子，为所有mRNA转录启动共有。它们的主要作用是，在启动子的TATA-box区与RNA聚合酶组装，形成转录的起始复合物，激活所有基因的转录。二、转录因子的种类真核生物中存在的三种RNA聚合酶，分别有相应的转录因子，即TF I、TF II、TF III。其中，TF II有几个亚类：TF II A、B、D、E、F、G/J、H和I；TF II D是唯一能识别启动子TATA-box，并与之结合的转录因子；而TF II B则可促进聚合酶II与启动子的结合。 二、转录因子的种类 特异性转录因子（specific t

9、ranscription factor）：也是一种DNA结合蛋白，是能够选择性调控某种或某些基因转录表达的蛋白质因子。它和DNA上其它调节元件结合，只能激活特定的基因转录，为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。第二节 转录因子的作用特点及其研究方法 一、转录因子的作用特点二、转录因子的研究方法 转录因子作用示意图一、转录因子的作用特点 同一DNA顺式作用元件可被不同的转录因子所识别； 同一转录因子也可识别不同的DNA顺式作用元件； TF与TF之间存在相互作用； 当TF与TF、TF与DNA 结合时，可导致构象改变； TF在合成过程中，有较大的可变性和可塑性。二、转录因子的研究方

10、法根据转录因子的作用特点，可采取不同方式来研究各种转录因子。DNA芯片技术，也称DNA微列阵技术（DNA microarray），是研究转录因子的方法之一。它是将不同序列的核酸样品高密度排列在载体上，然后将各种可能的转录因子与之进行结合，通过分析结合信号来研究二者相互作用的特点。 二、转录因子的研究方法与传统的“单基因” 技术比较，微阵列具有无可比拟的优势。该技术能在同一时间内对数千个基因表达谱的差异进行平行分析，从而可以对基因进行大量、快速、平行研究，实现高通量筛选；而且，还可得出其所筛选出的特异性配基的相对亲和力信息。 转录因子的DNA芯片技术研究第三节 一些常见的植物转录因子 一、植物中

11、常用的特异性转录因子二、植物中特有的转录因子Dof一、植物中常用的特异性转录因子不同逆境相关基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件，显示可以受到相同转录因子的调控，即转录调控基因可以通过调控一系列与逆境相关的功能基因的表达，从而明显提高植物对逆境的抵抗能力。因此，应用转录因子提高植物的抗逆性研究己经成为当今的研究热点。一、植物中常用的特异性转录因子 1、bZIP类转录因子2、ERF类转录因子3、WRKY类转录因子4、MYB类转录因子1、bZIP类转录因子碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子是普遍存在于动、植物及微生物中的一类转录因子。bZIP类转录因子，可识别含核心序列ACGT的顺式作用元件，如

12、CACGTG（G盒）、GACGTC（C盒）、TACGTA（A盒）等。一些受光或脱落酸（ABA）诱导的基因的启动子区都含有这些元件。1、bZIP类转录因子G盒元件普遍存在于受ABA、生长素、茉莉酸、水杨酸诱导的基因中，这证明它与植物的抗逆性有关。G盒元件还是光诱导基因中最常见的顺式作用元件之一，能激活光诱导基因的转录。2、ERF类转录因子乙烯应答元件结合因子（ERF），最先是从烟草中，作为GCC-box结合蛋白分离出来的。ERF蛋白具有一个高度保守的含58或59个氨基酸的DNA结合域。在拟南芥基因组中，有124个ERF 基因，参与对低温、干旱、病原体及其诱发因子的反应，构成一个转录因子基因家族。

13、这类基因家族在植物的生长、发育、抗病、抗胁迫以及次生代谢等方面起着非常重要的作用。该家族现只在高等植物中被发现。3、WRKY类转录因子WRKY是近年来发现的又一种植物特有的转录调节因子。这类蛋白含有12个保守的60个氨基酸的WRKY结构域。几乎所有WRKY转录因子对 （T）（T）TGACC（C/T）（即W框）都有结合特性。从欧芹中分离到的Pc WRKY I 基因的启动子，即含有3个TTGACC/T核心序列的类W框，这说明WRKY蛋白具有自我调节能力。3、WRKY类转录因子许多WRKY蛋白在病原体侵染反应和其它应激反应中起作用。有的WRKY蛋白在调控衰老中起作用，它们高水平的超表达可引起生长迟缓

14、和其它抗性相关基因的表达。4、MYB类转录因子MYB类转录因子家族，是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域是一段约51或52个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。MYB蛋白的共同特征是：N-端高度保守，通常由2个MYB结构域（R2、R3）或3个MYB结构域（R1、R2、R3）构成。4、MYB类转录因子绝大多数的MYB转录因子可以起到转录激活的作用，但有的MYB转录因子也可以降低目的基因的表达。在拟南芥和玉米中都存在着大量的MYB转录因子，它们是植物转录因子中最大的家族之一，并在转录调节中起着多方面的重要作用。4、MYB类转录因子从转录层面上来说，同一种胁迫可能会同

15、时激活多条途径（多个转录因子参与）；而同一转录因子也可能会由多种胁迫激活。从功能基因层面上来说，同一转录因子可能会同时激活多种功能基因；而同一功能基因也可能由多个转录因子调控，因为它的启动子区域可能存在不止一种顺式作用元件。 二、植物中特有的转录因子Dof Dof（DNA binding with one finger）蛋白是植物所特有的一类转录因子。Dof类转录因子在植物中发挥着多种功能。其N末端是独特和保守的，富含Cys残基的单锌指Dof结构域，是既与DNA又与蛋白相互作用的双重功能域，识别 的核心序列是AAAG；其C末端氨基酸序列较为多变，是Dof蛋白的特异转录调控结构域。拟南芥和水稻的

16、Dof转录因子家族为Aa、Bb、Cc、Dd这4个同源基因群，而同类群间可能有相似或相反的功能。二、植物中特有的转录因子Dof1、Dof蛋白的结构2、与Dof蛋白结合的DNA序列特异性 3、Dof蛋白与其它蛋白的相互作用4、Dof蛋白的生物学功能 1、Dof 蛋白的结构Dof蛋白仅在其N末端有1个52个氨基酸组成的高度保守的Dof结构域，在此结构域中CX2CX21CX2C基序形成一个单锌指结构，在此单锌指结构中，1个Zn2+与4个Cys残基共价配位结合。Zn2+和Cys残基对Dof蛋白的活性是必需的，二价离子螯合剂的存在以及对Cys残基的任何替换都会使Dof蛋白失活。1、Dof 蛋白的结构不同D

17、of蛋白，在与DNA结合的Dof结构域中，除了单锌指与DNA结合外，在锌指旁边C侧链状结构中，某些特定氨基酸也参与和DNA的结合，这些细微的特征有可能决定和不同的DNA序列的结合。Dof蛋白的转录调控结构域位于C末端，如玉米的ZmDof1的转录激活结构域是位于C末端的44个氨基酸残基；其它Dof蛋白，如拟南芥的OBP1、OBP2、OBP3和大麦的BPBF在C末端也有转录激活结构域。1、Dof 蛋白的结构转录调控结构域的氨基酸序列较为多变，不具保守性，这与Dof蛋白功能的多样性是一致的。综上所述，Dof蛋白通常包含2个主要的结构域：一个位于N末端的保守的DNA结合结构域和一个位于C末端的调控结构

18、域。在这两个结构域之间通常还有1个Ser骨架，可能作为分子铰链，连接这两个结构域。Dof蛋白的基本结构 2、与Dof蛋白结合的DNA序列特异性Dof蛋白以其Dof结构域与不同的植物特异性基因的启动子相互作用。在每一个Dof蛋白的DNA结合序列中，均存在AAAG序列（只有个别例外，如南瓜中的Dof蛋白AOBP识别AGTA序列），而且在这个序列上的任何单个突变都会取消Dof蛋白与DNA结合的特性，这说明AAAG序列是Dof蛋白识别的核心序列。2、与Dof蛋白结合的DNA序列特异性而AAAG的数目对Dof与DNA的结合能力也有影响：2个串联重复的AAAG基序表现出的DNA亲和 力比1个AAAG基序约

19、高2倍。外侧序列对Dof-DNA相互作用也有影响，不过，是有限的，仅在某种程度上影响二者相互作用。其它转录因子与之发生蛋白-蛋白之间的相互作用，以及转录后的修饰对Dof蛋白与其靶序列的特异性相互作用也有影响。 3、Dof蛋白与其它蛋白的相互作用Dof结构域是一个双功能的结构域，它不仅介导与DNA的结合，而且还介导蛋白与蛋白之间的相互作用。这种作用通常影响与DNA的结合，有时Dof与其它转录因子通过与DNA的协同结合作用共同调节基因的转录。3、Dof蛋白与其它蛋白的相互作用Dof蛋白与高迁移性染色质蛋白（chromatin-associated high mobility group，HMG）之

20、间有相互作用，不同HMG蛋白提高Dof蛋白的DNA结合性的程度不同。不同家族的转录因子进行的复合调控，可能是对转录因子在体外与体内作用有差异的一个比较合理的解释。Dof结构域的双重功能可能有助于其在体内对靶基因的正确激活或抑制。3、Dof蛋白与其它蛋白的相互作用除Dof结构域外，Dof蛋白的C端区域也是与其它蛋白作用的区域。与保守的Dof结构域不同，C末端变化多样，它很可能通过与不同类型调控蛋白或物质的反应，受不同途径信号的调控而激活或抑制基因的转录。这种多样性可能是Dof功能多样性的基础之一。 3、Dof蛋白与其它蛋白的相互作用玉米Dof1、拟南芥OBP13和大麦PBF的转录激活区域定位于每

21、个蛋白多变的C末端。玉米Dof1的转录激活区不仅作用于植物细胞，也作用于动物和酵母细胞。大麦PBF和SAD（scutellum and aleurone-expressed Dof）还与动、植物中均存在的MYB转录因子相互作用。MYB结合位点和Dof结合位点对MYB蛋白激活靶基因的转录都是必需的，这表明靶基因转录调控受多个调控因子协同作用。 3、Dof蛋白与其它蛋白的相互作用作为转录因子，Dof蛋白不仅通过Dof结构域直接与DNA结合，并在此区域与其它调控因子或蛋白结合，通过调节与DNA结合而调控基因的转录，而且与其它许多转录因子一样，在C末端专门有与其它蛋白或因子结合激活或抑制基因转录的区域

22、。这些不同位点调控的组合可能是Dof蛋白功能多样性的结构基础。4、Dof蛋白的生物学功能在多种植物特异性基因的启动子中都发现有Dof蛋白结合元件，这表明Dof蛋白有多种功能，参与植物多种生命活动的调控。第四节 动物中的转录因子MyoD 转录因子家族，通常是由各种同源和异源的二聚体亚基组成。它们在细胞内具有不同的调控作用，这取决于细胞接受的刺激和信号因子的存在。因此，可通过检测在细胞内调控作用中含有哪些转录因子家族成员，以帮助鉴定和提供潜在的基因有用信息。第四节 动物中的转录因子MyoDmyoD 基因的全称是myogenic differentiation antigen（成肌分化抗原），是以其

23、命名的一个调控成肌细胞分化的转录因子家族的重要成员。该家族成员的时空表达具有特异性，但是都参与成肌细胞的分化和特化过程，是对于肌肉组织发育具有重要作用的转录因子家族。单向分化（肌细胞分化涉及转录因子的次序表达）示意图 第四节 动物中的转录因子MyoD通过结构比对的方法，确定了人的MyoD家族的4个成员：MyoD、Myogenin （Myf4）、 Myf5和Mrf4。它们在结构上类似的区域就是与DNA结合并且激活成肌作用的区域。从体节细胞分化为成肌细胞时，需MyoD和Myf5两种蛋白，而从成肌细胞合并发育分化为成熟的骨骼肌细胞则依赖于myogenin 基因。细胞融合前只有myoD 及myf5基因

24、表达，myogenin 基因只有在细胞融合发生后，才能表达，且受myoD 及myf5表达的诱导。 myoD 家族基因敲除对小鼠骨骼肌细胞分化发育的影响 第四节 动物中的转录因子MyoDMyoD家族在肌肉细胞系的分化特化过程中有重要作用，它们只表达在骨骼肌细胞和它们的前体细胞中，非肌肉细胞系中MyoD家族成员的表达会被其它特异性的基因抑制。但myoD 基因可以激活自身的表达，这对于保持成肌作用具有重要意义。 第四节 动物中的转录因子MyoD一、myoD 基因的定位二、myoD 基因的结构与功能一、MyoD基因的定位 利用分子杂交的方法，将myoD 基因定位于人类的第11号染色体上，还利用小鼠的探

25、针做了检测并显示出相同的结果。进一步研究将其定位在染色体11p15.4p15.1区域，但是利用荧光原位杂交（FISH ）的方法定位，结果是其位于11p14.3区域。 在不同生物中的这些表达和定位的结果显示了，标志性基因都包含myoD ，这为研究myoD 基因的表达和具体功能提供了方法和方向。 小鼠11.5天的胚胎图（示myoD 基因的表达分布） 荧光原位杂交定位人类myoD 基因示意图 非洲爪蟾发育尾芽时期X-myoD 的表达 原位杂交显示myoD在斑马鱼中的表达 免疫染色和DAPI染色共定位二、myoD 基因的结构与功能MyoD家族蛋白结构上的最大特点是含有b-HLH结构域。其中，Basic

26、结构域是HLH螺旋结构的延伸，也是这一家族蛋白与DNA相互作用的区域；而HLH螺旋结构则是与许多其它因子相互作用的位点，是调控的重要区域。 MyoD的b-HLH结构域 二、myoD 基因的结构与功能在哺乳动物中，MyoD能诱导肌细胞特异性基因转录，与肌肉发育有紧密的相关性。MyoD家族蛋白在形成同源及异源二聚体后，可与基因调控区中的CANNTG序列（又称E-box）相结合，通过DNA-protein相互作用，MyoD构象发生改变，从而诱导肌细胞特异性的基因转录。 MyoD的作用过程 形成转录起始复合体，促进靶基因的转录 二、myoD 基因的结构与功能前图表明：MyoD及其它MRF（muscle

27、-related factor）与其它非组织特异性bHLH蛋白（如E2A）结合而成的异源二聚体，以及MEF （muscle-enhancer factor）同源二聚体，与调控元件E-box或MEF-box，或同时与二者结合形成转录起始复合体，促进靶基因的转录。 总之，myoD 基因家族是一个与肌肉发育分化特化过程密切相关的转录因子，它可以被多个信号通路调控，对于维持体内肌肉的生成和替代起着关键的作用。肌细胞分化与细胞周期 分裂中的成肌细胞不能分化 分化中的肌细胞不能分裂 第五节 热休克转录因子HSF 热休克基因表达的调节主要发生在转录水平，热休克基因的表达受到一个重复DNA序列的可逆的顺式负调

28、节（negative cis-acting control）。热休克转录因子（ HSF，热激蛋白）的结构和功能在进化中较少变异，因此具有广泛的同源性，在真菌、果蝇、鸡、人类等真核生物中都存在。热休克蛋白（HSP）还可作为“分子伴侣”（molecular chaperone）参与其它蛋白的折叠。 第五节 热休克转录因子HSF一、HSF的类别与功能二、HSF的结构三、HSF活化及作用过程一、HSF的类别与功能 从HSF发现到现在，随着研究的深入及新技术的采用，在不同生物体内，发现了越来越多的HSF及其基因，例如：人体内有hHSF1、2、4，鸡体内有cHSF1、2、3，小鼠体内有mHSF1、2；西红

29、柿有3种HSF；而只有一种HSF的生物也 很多。HSF在热应激反应中的主要功能是：在热休克基因的表达过程中，与相应启动子结合，启动基因的转录过程，最终促进HSP的表达。 一、HSF的类别与功能但在高等真核生物（如脊椎动物及哺乳动物）体内，不同种类的HSF，虽然结构上很相似，但功能上却出现了不同程度的差异，在不同的应激状态下起作用。其中，只有HSF1是最有代表性、最具有完全意义的HSF，能在热休克、氧化应激、重金属应激等状态下起作用，而其它HSF则不然，如：HSF2。HSF2对热刺激信号耐受，能在精子形成和胚胎发育中起作用；它对代表生长、发育、分化的信号更为敏感。一、HSF的类别与功能cHSF3

30、虽然也对热刺激信号起反应，但其活化阈值却高于cHSF1，在较高温度时仍能保持活性。而hHSF4似乎是一个通过减少热休克蛋白效应元件（HSE）结合位点，而专门起抑制作用的HSF，其生物学意义在于控制热应激反应的动态平衡。 二、HSF的结构 虽然从不同生物体内分离出来的HSF分子种类和大小各有不同（如从酵母菌、果蝇、人类体内分离出来的HSF，其分子量分别为：150、110、80 ku），但其结构却极为相似，共同具有一个极为保守的核心区域DNA结合区域（DNA binding domain）和三聚区域（trimerization domain）。 二、HSF的结构DNA结合区域，靠近HSF的N末端，

31、位于HSF最保守的区域中。其晶体结构与溶解状态的结构比较一致，都具有DNA结合蛋白特征性的helix-turn-helix motif，由3个螺旋（H1、H2和H3）和4个反向平行的片层（-sheet）（1、2、3和4）组成，其排列顺序如下： 二、HSF的结构DNA结合区域通过螺旋-转角-螺旋结构形成一个紧密的球形结构。但与其它DNA结合蛋白（如：CAP）的DNA结合区域不同的是：HSF的DNA结合区域有一个螺旋凸起（-helical bulge）；一个由脯氨酸诱导的扭结（proline-induced kink），该扭结使H2发生明显扭曲；在H2和H3之间有一段57个氨基酸的间隔。 二、HS

32、F的结构对于非植物性来源的HSF，在3和4之间还有一个暴露的、易曲的可溶性环状结构。HSF的DNA结合区域，与DNA结合的部位起始于H1的N端后数个氨基酸处；终止位置对于不同的HSF并不一致，但多数终止位置位于4末端 之后的16个氨基酸处。二、HSF的结构这16个氨基酸的功能，一方面是通过与疏水核心的相互作用，在空间结构上封闭DNA结构区域的一个侧面；另一方面，是使HSF三聚体中各HSF单体的DNA结合区域相互协调，以获得对热休克元件（HSE）的高亲和力。 DNA通过主沟与HSF结合，具体结合位点就是DNA上的HSE。HSF能识别HSE上特异性的“-nGAAn-”结构，HSF单体与“-nGAA

33、n-”结构以1:1的比例结合。热激蛋白调控的基因表达二、HSF的结构HSE上“-nGAAn-”结构的数目，对HSF与HSE亲和性有很大的影响。一个完整的HSE结构上通常有3个“-nGAAn-”结构，而完整的HSF也是以三聚体的形式与HSE结合，这样的结合具有最大的亲和力。若HSE上只有2个“-nGAAn-”结构，两者的亲和力只能达到中等水平。许多物理学与遗传学证据都表明，DNA结合区域螺旋-转角-螺旋结构上的第3个螺旋（H3）起识别HSE上“-nGAAn-”结构的作用。 二、HSF的结构H3通过其极性及阳性氨基酸残基，在溶液中形成一个典型的双岐性螺旋（Amphipathic helix），与D

34、NA通过离子键相互作用。当HSF活化时，相互间需通过三聚区域结合形成HSF三聚体。相对于DNA结合区域，三聚区域位于HSF中部。三聚区域的特征性结构是3个疏水七氨基酸重复序列（Hydrophobic heptad repeat array）。 二、HSF的结构这3个序列由数目不等的七氨基酸重复（Heptad repeat）构成。第1个序列较长，有56个七氨基酸重复；第2和第3个序列较短，且基本上重叠在一起，前后只差一个氨基酸；第1个序列与 后两个序列之间由QQQ基元（QQQ motif）隔开。 每个七氨基酸重复单位的第一和第四个疏水氨基酸残基，是螺旋型卷曲螺旋结构（Helical coiled

35、-coil structure）所特有的，可用于形成亮氨酸拉链（leucine zipper）。二、HSF的结构但具有亮氨酸拉链的蛋白，通常形成同二聚体或异二聚体，像HSF这样形成三聚体的非常少见。三聚体的空间结构比预期的紧密。因此，HSF三聚区域的空间结构并非如所想像的是一个简单的连续卷曲-螺旋（coiled-coil）。其构型可能与流感病毒血凝素的三聚区域相似：较长的七氨基酸重复序列内部相互作用，形成一个三链螺旋型卷曲螺旋（triple-stranded -helical coiled-coil），其外部由较短的七氨基酸重复序列形成一个螺旋，以稳定其结构。 二、HSF的结构除DNA结合区域

36、与三聚区域外，促进热休克基因转录的活化区域（activator domain）也是HSF较重要的结构之一。但活化区域与上述两个结构区域不同，其物种间的同源性不高，位置也不很确定。通过遗传学方法，可将Kl HSF（Kluyveromyces lactis HSF）的C末端活化子（carboxy-terminal activator，CTA）定位于C末端的32个氨基酸残基内；而Sc HSF（Saccharomyces cerevisiae HSF）的CTA则散布于180个氨基酸残基内。二、HSF的结构N-末端活化子（N-terminal activator，NTA）的具体位置尚未确定。高等真核生物

37、的活化区域可能位于C末端的某些区域。例如：hHSF1有2个独立的活化区域，位于靠C端1/3处，受所谓中心调节区域（central regulatory domain）调节；该调节区域位于三聚区域与该活化区域之间，对热刺激信号敏感。CE2是位于HSF的C末端的一小段序列，也是HSF最保守的序列之一，能够抑制HSF的转录促进功能。但CE2仅见于酵母菌，高等生物缺乏这一结构。 三、HSF活化及作用过程 多种内、外界刺激因素均可活化HSF，其中以热休克为最典型、最传统的活化方式。细胞受到高温刺激后，促进HSF活化。 HSF从无活性到有活性，通过以下3个步骤被活化：（1）HSF由单体形式变成磷酸化的三聚

38、体形式而被激活；（2）三聚体与HSE结合；（3）转录活化区域开放，促进HSP转录。 （1）HSF由单体形式变成磷酸化的三聚体形式而被激活在无应激状态下，HSF以无活性的单体形式存在。单体是在常温时，HSF内1区与C末端4区形成亮氨酸拉链维系高级结构。当细胞处于应激状态时，细胞内环境发生变化，解除了对HSF的活性抑制，促进HSF由单体向三聚体转换。HSF之间通过三聚区域结合，具体位点是三聚区域的3个七氨基酸重复序列，主要依赖三个单体 彼此的1区、2区、3区，形成单体之间的亮氨酸拉链。 （1）HSF由单体形式变成磷酸化的三聚体形式而被激活在无应激时，这3个序列在HSF内部形成稳定的卷曲螺旋结构，以

39、维持其单体状态；在应激时，在不明机制的作用下，卷曲螺旋结构打开，相邻HSF的七氨基酸重复序列之间相互作用，形成分子间的卷曲螺旋。在此结构帮助下，每3个HSF单体结合在一起，形成一个三聚体。 （2）三聚体与HSE结合HSF单体基本上不能结合HSE，只有形成三聚体后，两者的亲和性才大大增强。HSF与HSE亲和力的大小不仅与HSE内的“-nGAAn-”数目有关，而且HSF三聚体之间的协作也能极大地促进两者的结合。在热休克基因转录起点上游数百bp处，往往有多个拷贝的HSE；HSF与2个紧邻HSE的亲和力比与单个HSE的亲和力高出近2千倍。 （3）转录活化区域开放，促进HSP转录对Kluyveromyc

40、es lactis 等较低等的真核生物而言，HSF与HSE的结合过程与HSF促进转录过程是偶联的；两者结合后，随HSF上活化区域的暴露，即可促进热休克基因的转录。但高等真核生物的情况比较复杂，虽然通常两者也能偶联，但在一定的条件下，HSF与HSE结合并不能促进热休克基因的转录，即这两者是两个相互独立而非偶合的过程。这说明：在高等真核生物体内，对HSF的DNA结合功能和转录促进功能的调节各有其机制。 HSF活化后，促进HSP转录示意图 （3）转录活化区域开放，促进HSP转录在通常情况下，两者互相协调；但是在一定条件下，可将两者分开。与HSF活化紧密相关的还有HSF的定位及HSF的磷酸化等过程。

41、生物体内、外多种调节因素对HSF的调节基本上是围绕这3个HSF在热应激反应中发挥功能的关键步骤进行的。HSF除了在热应激反应中能调节HSP的合成外，有的还能在某些生理和病理状态下发挥作用。第六节 一些转录因子的实例 一、肠特异性转录因子CDX2二、转录因子Blimp-1三、FOXP3四、免疫相关转录因子GATA-3五、核转录因子B（NF-B）六、Spl七、PAX5一、肠特异性转录因子CDX2 CDX2是肠表皮细胞早期分化和特性维系的关键转录因子，不仅控制着胚胎的发育和分化，而且在成人组织的分化和增殖中起着重要作用。而作为肠型特异性基因的表达产物，CDX2表达于正常肠道组织，在小肠和盲肠中表达较

42、高，在远端结肠中表达降低，在肠道肿瘤组织中表达则明显下降。CDX2具有抑制结肠癌的功能，过表达明显抑制结肠生长，而促进其分化。 一、肠特异性转录因子CDX2CDX2通过核移位和翻译后磷酸化水平修饰，调节其转录活性，发挥对靶基因的调控作用。肠型胃腺癌的发生，与肠特异性转录因子的转录调控失常密切相关。 CDX2蛋白在不同胃粘膜病变中的表达（超敏SP法） ABCD一、肠特异性转录因子CDX2CDX2蛋白主要表达于胃粘膜肠化生（intestinal metaplasia）灶中的杯状细胞及柱状上皮细胞（前图A），以及肠型胃癌细胞的细胞核（前图B），呈浅棕黄色颗粒样着色，近核周的胞浆中也有少量细颗粒样着色

43、；在部分弥漫型胃癌细胞胞浆及胞核中也有弱到中等程度的着色（前图C）；在少部分CAG病例的胃腺凹上皮中也有棕黄色粗大颗粒样胞浆着色（前图D）。 二、转录因子Blimp-1 转录因子Blimp-1（B lymphocyte induced maturation protein 1）（人的蛋白被称为PRDI-BF1）是具有5个锌指结构的蛋白，它可诱导成熟B淋巴细胞发育为浆细胞并分泌抗体，因此被称为“B淋巴细胞终极分化的主调控子”。 Blimp-1至少通过3个基因表达程序诱导了浆细胞发育：（1）Blimp-1阻断B细胞增生程序，主要包括直接抑制c-myc，下调E2F-1及抗凋亡基因A1，上调cdk 抑

44、制子p18和p21；（2）Blimp-1上调促使Ig分泌的基因，包括重链及轻链基因、J链、XBP-1、CHOP、hsp70等；（3）Blimp-1下调在形成生发中心和B细胞激活中起重要作用的基因，包括Pax-5、Bcl-6、AID、BCR 信号传导相关基因、CD72、CXCR5等。 二、转录因子Blimp-1Blimp-1在生发中心B细胞和边缘区B细胞分化为浆细胞的过程中发挥了关键的作用，它在浆细胞发育中的作用是不可缺少的。多发性骨髓瘤病人中B细胞表达Blimp-1，而 正常人B细胞不表达Blimp-1。未成熟Blimp-1的表达加上Pax-5表达的缺失，使B细胞过早增生和分化，可能与多发性骨

45、髓瘤的发生相关。三、FOXP3 FOXP3是FOX（forkhead box）家族（叉头样转录因子家族）转录因子中的一员。FOX转录因子最初在果蝇中被发现，如今FOX转录因子家族具有100多个成员。FOX转录因子在免疫调节的各个方面（包括从淋巴细胞的存活到胸腺的发育）发挥着重要作用。FOXP3主要是一个与调节性T细胞的生成及功能有关的转录因子。 三、FOXP3在小鼠体内，仅表达于CD4+CD25+T细胞，在人类则不仅可表达于CD4+CD25+T细胞，还可表达于CD8+CD28-T细胞，但以前者为主。它的表达及功能与调节性T细胞（regulatory T cells，TR细胞）密切相关。调节性T

46、细胞，是体内非常重要的T细胞亚群，在自身免疫、肿瘤免疫及移植免疫中均能发挥作用。三、FOXP3胸腺中未成熟T细胞及外周调节性T细胞在其受体被结合后，以及在TGF-和雌激素刺激下，FOXP3表达均增高，并可通过抑制IL-2的表达及上调血红素加氧酶-1的表达等而发挥免疫抑制作用。如果FOXP3 基因发生突变，将影响TR细胞的发育成熟，导致IPEX综合征（immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) 。 四、免疫相关转录因子GATA-3 转录因子GATA-3属锌指家族转录因子，主要调节T细胞等免疫细胞发育

47、、增殖和分化。GATA-3是T祖细胞发育中所必需的转录因子，被称为“T细胞的特异性活化子”，并可调节TCR 基因的表达。CD8+基因的启动子及增强子上具有GATA-3的结合位点，且GATA-3在胸腺细胞发育过程中调控CD8+基因的表达。四、免疫相关转录因子GATA-3GATA-3参与维持正常骨髓造血及微环境造血调控。在再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)的病理状态下，骨髓微环境中GATA-3 基因的表达明显受到影响，GATA-3的异常表达上调可能与AA的骨髓中出现异常活化的淋巴细胞有关。四、免疫相关转录因子GATA-3GATA-3通过影响CD8+等相关基因表达和/或调控Th细

48、胞亚群来影响机体免疫功能。AA的骨髓基质细胞（BMSC）和骨髓细胞中GATA-3的表达异常，可能是导致AA骨髓中T细胞功能异常和自身反应性T细胞产生的主要原因之一。GATA-3的异常上调表达对AA的骨髓微环境和造血细胞均有影响，GATA-3可能从调控微环境基质细胞和免疫细胞两方面参与AA的发病机制，也说明在骨髓微环境中存在着AA致病的免疫素。 五、核转录因子B（NF-B） 核转录因子B（NF-B）是一类在动物细胞中广泛表达的转录因子，能与某些基因的增强子上B位点结合，并启动、促进相应基因转录。在B细胞核蛋白提取物中，有能与免疫球蛋白轻链基因的增强子B序列特异结合的蛋白。B位点还广泛存在于淋巴细

49、胞、病毒、细胞因子的增强子上，其调控的基因大都与免疫应答及炎症反应有关。因此，NF-B是参与这类应激反应的蛋白质基因转录的调控因子。 NF-B参与的信号传导五、核转录因子B（NF-B）有生理功能的NF-B是由P50和P65两个亚单位构成的异源二聚体。其主要生理功能之一是：通过诱导凋亡抑制基因的转录，拮抗细胞凋亡的发生，它们几乎存在于所有细胞中。调节一系列的病理和生理反应，在细胞生长、分化、增殖、凋亡，尤其在炎症反应和免疫应答中处于重要地位。抑制NF-B的过度表达可阻断其靶基因产物的产生。NF-B除了能介导多种炎性介质转录表达外，它也参与细胞凋亡的调控，主要通过调控凋亡相关的重要基因表达。五、核

50、转录因子B（NF-B）当NF-B激活时，可抑制细胞凋亡并延长细胞生存周期，所以细胞凋亡及NF-B活化的异常会导致多种人类疾病。例如：NF-B在肝纤维化过程中一方面形成“炎性瀑布”，造成肝脏损伤；另一方面促进HSC的增生、活化，并且抑制其凋亡，从而推进肝纤维化的进程。目前，许多研究者试图通过改变NF-B活性来调节细胞的应激感染性，尤其在肿瘤及抗炎症治疗领域，这一思路引起了广泛的兴趣。 六、Spl Spl是序列特异性的DNA结合蛋白，可调控某些启动子中富含GC序列的细胞和病毒基因的转录过程。近来，与Spl具有相似结构及转录特性的转录因子（Sp2、Sp3、Sp4）也相继被发现和克隆，由此构成了Sp

51、多基因家族。对许多可调控肿瘤细胞生存、生长和血管生成的基因而言，Spl是一个重要和必需的转录因子。 六、SplSpl的异常表达和活化，可通过促进相关肿瘤生长因子和血管生成基因表达等机制，营造适宜肿瘤生长的局部微环境，正向调节肿瘤增殖、转移潜能和血管生成。可受Spl蛋白调节的基因有：成纤维细胞生长因子受体-1、类上皮生长因子受体、类胰岛素生长因子受体-1、类胰岛素生长因子结合蛋白-2、血管内皮生长因子（VEGF）、胸腺嘧啶激酶等。 六、SplSpl还可调节Bcl-2、Bax等细胞凋亡相关蛋白的启动子，通过调控细胞凋亡影响肿瘤细胞的生存和转移潜能。在正常胃黏膜和胃癌组织中，Sp1蛋白表达具有不同的

52、分布特征。Sp1可作为判断胃癌患者预后的一个独立指标，并可能通过除淋巴结转移以外的其它机制促进肿瘤的侵袭和发展。 七、PAX5 PAX（paired box）5基因是配对区PAX 基因家族的成员，该家族产生的蛋白都含有一个编码128个氨基酸的配对结构域。它编码的核反式作用因子B细胞特异性激活蛋白（B-cell specific activator protein，BSAP）在发育的中枢神经系统、成人睾丸和B淋巴细胞中表达。 七、PAX5比较不同化疗阶段B-ALL（儿童急性白血病）患儿PAX5 mRNA的表达发现，初诊化疗前组患儿与复发组患儿的平均PAX5 mRNA表达差异无显著意义（P 0.0

53、5），而化疗缓解组患儿的平均PAX5 mRNA表达下降（最小残留白血病细胞，即MRD0.01%），与初诊化疗前组和复发组患儿的差异均具有显著意义（P 0.05）。在B-ALL中，PAX5通过调控其目标基因CD19 表达，来影响细胞内多种信号传导途径，进一步可能影响肿瘤的发展。第七节 人工转录因子 如前所述，转录因子是真核表达调控中非常重要的一类反式作用因子，通常由DNA结合结构域与效应结构域两部分组成，这两个结构域可以各自独立发生作用。基于转录因子的这种结构特点，可以人为地选择针对特定序列的DNA结合结构域与具有特定作用的效应结构域构建人工转录因子。 第七节 人工转录因子目前，人工转录因子的D

54、NA结合结构域多为C2H2型锌指结构。每一个锌指单元由大约30个氨基酸组成，识别DNA双螺旋大沟中相连的3bp序列，并可通过氢键作用与相应的碱基结合；多个锌指可以串联成簇，从而识别并结合较长的DNA序列区域。常见的人工转录因子的效应结构域有激活结构域以及抑制结构域，不同的效应结构域赋予人工转录因子不同的功能。 第七节 人工转录因子一、人工转录因子的结构二、获得特异识别DNA序列的锌指蛋白三、人工转录因子的应用一、人工转录因子的结构 早期的人工转录因子，只是简单地将某种已知转录因子的DNA结合结构域，与另一种已知转录因子的效应结构域组合在一起，所得到的融合蛋白。例如：1985年Brent等将酵母

55、转录因子Gal4的转录激活结构域与细菌LexA蛋白的DNA结合结构域融合在一起，得到的新型转录因子可以作用于含有LexA操纵子序列的启动子，并激活其下游基因的表达。当时人们将这种实验称为“domain swap experiments”。如今，种类繁多的DNA结合结构域以及效应结构域被应用于人工转录因子的构建。 一、人工转录因子的结构1、DNA结合结构域2、效应结构域（1）激活结构域 （2）抑制结构域（3）效应结构域的拓展 1、DNA结合结构域在人工转录因子的设计中使用的DNA结合结构域，根据其构成，分为：非蛋白结构模块与蛋白结构模块两大类。非蛋白结构的DNA结合结构域，包括三链形成寡核苷酸（

56、triplex-forming oligonucleotide，TFO）、肽核酸（PNA）以及聚酰胺（polyamides）等。 1、DNA结合结构域TFO与PNA都是通过与靶序列形成三链而识别特异序列的；而聚酰胺则是通过与DNA的小沟结合来进行序列识别的，已经设计出了可以特异识别4bp序列的聚酰胺分子。蛋白结构的DNA结合结构域，包括螺旋-转角-螺旋结构、类固醇受体以及锌指结构等。这些结构是天然的转录因子中经常出现的组成部分，其中锌指结构以其小巧灵活、结构独特而备受关注。 1、DNA结合结构域C2H2锌指结构是Miller等最先在非洲爪蟾的转录因子TF III A中发现的，是真核细胞中最常见

57、的DNA结合模体（motif）。在人类基因组中，大约有2%的基因编码C2H2锌指结构。多个锌指单元可以串联成簇，识别更长的DNA序列。 锌指单元的结构1、DNA结合结构域锌指蛋白Zif-68包含3个锌指单元。对于Zif-68与其靶DNA序列相互作用所形成复合物晶体的X射线衍射分析，揭示了C2H2锌指与DNA作用的特点：每一个锌指单元的螺旋伸入DNA的大沟中，通过螺旋外侧的氨基酸来识别DNA双螺旋大沟中的相邻的34bp序列，并可通过氢键作用与相应的碱基结合。 1、DNA结合结构域C2H2锌指结构还能识别修饰过的DNA碱基，如5-甲基胞嘧啶。相对于其它DNA结合结构域，C2H2锌指有很多的优点：例

58、如，许多DNA结合结构域由于自身是对称或者二聚化的结构而只能识别对称序列，而C2H2锌指则可以识别非回文序列；并且由于可以多个锌指单元串联，C2H2锌指对于其识别序列的长度和结构没有太多的限制，仅仅需要改变几个关键位点的氨基酸，就可以赋予锌指新的识别特性。 1、DNA结合结构域从理论上讲，对于任意DNA序列，都能找到能够与之特异结合的C2H2锌指。基于锌指结构相对于其它DNA结合结构域的优势，目前大多数人工转录因子都以锌指结构作为DNA结合结构域。自从应用了锌指结构之后，人工转录因子才真正实现了模块化设计。 2、效应结构域在早期人们发现，仅仅是DNA结合结构域对于基因转录以及表达可能会产生一定

59、的抑制作用。其原因可能是：诸如锌指蛋白这样的DNA结合结构域过量表达，并结合在基因的编码区，从而阻碍了基因转录的进行；也有可能是：结合在基因启动子区域，占据了某些转录必需的转录因子的结合位点（如果是占据抑制因子的作用位点，则有可能有一定的上调作用）。2、效应结构域不过这些作用的强度是很有限的，而且情况因研究体系的不同而差别很大。因此，目前在人工转录因子的设计中，通常都要加上不同的效应结构域，以赋予人工转录因子不同的功能。 2、效应结构域（1）激活结构域（2）抑制结构域（3）效应结构域的拓展（1）激活结构域常用的激活结构域有来自NF-B的p65亚基（288548位氨基酸）以及来源于单纯疱疹病毒（

60、herps simplex virus）的VP16等。利用VP16的413490位氨基酸部分，可很有效地激活（上调）基因的转录。VP16的437447位氨基酸DALDDFDLDML，也可产生明显的激活作用；再缩小至78个氨基酸，或者DDFDL这5个氨基酸，仍有很强的激活作用。（1）激活结构域许多被称为AH（amphipathic helix）的模拟天然激活区域的15个氨基酸的人工肽也被用在人工转录因子的构建中。近年来，还发现形成发卡的RNA分子对于基因的转录，也能产生一定的激活作用。 （2）抑制结构域常用的抑制结构域有：转录因子KOX1的KRAB（krppel-associated box）结