实验5 培养基的使用特点和微生物接种方法

1、实验五实验五微生物接种方法及微生物微生物接种方法及微生物测量方法测量方法实验目的与要求实验目的与要求 （p9/32)n强调强调无菌操作概念，掌握无菌操作技术无菌操作概念，掌握无菌操作技术n掌握微生物移植、纯化的基本方法掌握微生物移植、纯化的基本方法n了解不同微生物在同一培养基上的培养特征，了解不同微生物在同一培养基上的培养特征，及同一微生物在不同培养基上的培养特征及同一微生物在不同培养基上的培养特征n掌握几种常用的鉴别、选择培养基的使用掌握几种常用的鉴别、选择培养基的使用n了解显微测微尺的构造；掌握应用显微测微了解显微测微尺的构造；掌握应用显微测微尺测量微生物细胞大小的方法与技术尺测量微生物细

2、胞大小的方法与技术 微生物培养微生物培养Culture：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体混合培养物：混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物：纯培养物： 只有一种微生物的培养物；Pure culture通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果纯培养技术纯培养技术是进行微生物学研究的基础！是进行微生物学研究的基础！一、用固体培养基分离纯培养一、用固体培养基分离纯培养培养基：液体培养基；固体培养基；固体培养基； 1.5%-2.5%半固体培养基；半固体培养基； 0.2%-0.75%琼脂一、用固体培养基分离纯培养一、用固体培养基分离纯培养菌落（菌落（colony）： 单个（或聚集在一起

3、的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体众多菌落连成一片菌苔（菌苔（lawn）无菌操作：无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行 不同微生物在特定培养基上生长形不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据物进行分类、鉴定的重要依据菌落的描述：菌落的描述：形态、表面和边缘特征形态、表面和边缘特征同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落同一细菌在

4、不同的培养平板上形成不同的特征菌落一、用固体培养基分离纯培养一、用固体培养基分离纯培养使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：1、稀释倒平板法、稀释倒平板法2、涂布平板法、涂布平板法3、平板划线法、平板划线法4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离一、用固体培养基分离纯培养一、用固体培养基分离纯培养1、稀释倒平板法2、涂布平板法操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！利用利用L棒进行涂布棒进行涂布3、平板划线法、平板划线法3、平板划线法一、用固体培养基分离纯培养4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离

5、厌氧罐厌氧手套箱二、选择培养分离二、选择培养分离t 抑制大多数其它微生物的生长；抑制大多数其它微生物的生长；t 使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物生长更快；对微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化对微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物 生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。三、选择培养分离三、选择培养分离1. 利用选择平板进行直接分离利用选择平板进行直接分离待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制待分离的微生物生长

6、，其它微生物的生长被抑制t 高温下培养：分离嗜热细菌；高温下培养：分离嗜热细菌；t 培养基中不含培养基中不含N：分离固氮菌；分离固氮菌；t 培养基加抗生素：分离抗性菌；培养基加抗生素：分离抗性菌；1. 利用选择平板进行直接分离利用选择平板进行直接分离t 颜色反应：分离特定的菌株；t 牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；待分离的微生物的生长特待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物征明显不同于其它微生物2. 富集培养富集培养富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特理条件的几乎无穷尽的组

7、合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。定微生物的需要。n组成成分：乳糖、胆盐、柠檬酸铁、柠檬酸纳、煌组成成分：乳糖、胆盐、柠檬酸铁、柠檬酸纳、煌绿、中性红、硫代硫酸钠等，强选择性抑制大肠杆绿、中性红、硫代硫酸钠等，强选择性抑制大肠杆菌，菌，分离沙门菌分离沙门菌n煌绿、胆盐、柠檬酸纳抑制非肠道菌煌绿、胆盐、柠檬酸纳抑制非肠道菌n大肠杆菌分解乳糖而产酸，使胆盐析出，菌落中大肠杆菌分解乳糖而产酸，使胆盐析出，菌落中心浑浊呈深红色，柠檬酸铁可使产生硫化氢的菌心浑浊呈深红色，柠檬酸铁可使产生硫化氢的菌落呈黑色落呈黑色n硫代硫酸钠缓和胆盐对沙门氏菌的有害作用，中硫代硫酸钠缓和胆盐对沙门氏菌的有害作

8、用，中和煌绿、中性红的毒性，使大肠杆菌的红色菌落和煌绿、中性红的毒性，使大肠杆菌的红色菌落更加鲜艳更加鲜艳S.S琼脂琼脂（沙门氏菌、志贺氏菌分离用培养基）（沙门氏菌、志贺氏菌分离用培养基）常用的选择培养基常用的选择培养基n麦康凯培养基麦康凯培养基n乳糖、胆盐，弱选择性，中性红乳糖、胆盐，弱选择性，中性红, ,分离肠道致病菌分离肠道致病菌n中性红指示剂中性红指示剂npHpH感应范围感应范围6.86.8（红色）到（红色）到8.08.0（黄色）（黄色）n分解乳糖产酸，分解乳糖产酸，菌落颜色呈红色菌落颜色呈红色n沙门氏菌、志贺氏菌不分解乳糖，沙门氏菌、志贺氏菌不分解乳糖，菌落颜色与培养基相菌落颜色与培

9、养基相同同n胆盐有助于沙门氏菌的生长，抑制其他细菌胆盐有助于沙门氏菌的生长，抑制其他细菌常用的选择培养基常用的选择培养基常用的选择培养基常用的选择培养基n沙门菌常用的培养基：沙门菌常用的培养基：n亚硫酸铋琼脂平板亚硫酸铋琼脂平板(BS):(BS):n含有煌绿、柠檬酸铋铵、亚硫酸钠、硫酸亚铁，含有煌绿、柠檬酸铋铵、亚硫酸钠、硫酸亚铁，具有强选择性，分离沙门氏菌具有强选择性，分离沙门氏菌nHEHE（HeetoenHeetoen) )：n柠檬酸铁铵、去氧胆酸盐、硫代硫酸钠、麝香柠檬酸铁铵、去氧胆酸盐、硫代硫酸钠、麝香草酚蓝和复红，分离肠道致病菌草酚蓝和复红，分离肠道致病菌n三糖铁琼脂或克氏双糖铁三糖

10、铁琼脂或克氏双糖铁n三糖铁琼脂三糖铁琼脂含有乳糖、蔗糖、和葡萄糖，蔗糖：区别普含有乳糖、蔗糖、和葡萄糖，蔗糖：区别普通变形杆菌（）、沙门氏菌（通变形杆菌（）、沙门氏菌（- -）n克氏双糖铁克氏双糖铁成分成分 蛋白胨；蛋白胨； 牛肉膏牛肉膏 ； 酵母膏酵母膏 ；乳糖；乳糖 ； 葡萄糖；葡萄糖； 氯化钠氯化钠 ； 柠檬酸铁铵柠檬酸铁铵 ；硫代硫酸钠；硫代硫酸钠 ； 琼脂琼脂 ；酚红酚红为指示剂，为指示剂，黄色黄色为产酸，为产酸，红色红色为产碱为产碱n观察观察克氏双糖克氏双糖接种后斜面、底层产酸、产气、产接种后斜面、底层产酸、产气、产H H2 2S S的情况，的情况，通常通常大肠杆菌斜面不产酸、底层

11、产酸产气、不产大肠杆菌斜面不产酸、底层产酸产气、不产H H2 2S S微生物大小测量原理（P48）n微生物细胞的大小是其形态特征之一，也是鉴定的依据之一。在研究工作中有时要测定显微镜下微生物细胞的大小，使用工具为显微测微尺。n显微测微尺有镜台测微尺和目镜测微尺。目镜测微尺是一块可放在目镜内的园形玻片。在玻片中央把5mm长度，刻成100等分的小格，其目镜测微尺经过镜筒光学系统后，其每格尺寸随镜筒长度变化而变化，也随放大倍数而变化，因此必须选定显微镜及放大倍数。然后用已知长度的镜台测微尺来校准，计算出物镜下接目测微尺每小格的长度。然后才可用接目测微尺直接测量标本的长度和宽度。镜台测微尺是一中央部分

12、刻有精确等分线的载玻片，其每格长度为10um，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。操作步骤n1，先将目镜测微尺装入目镜中，方法是：先拨出目镜，旋下目镜上的透镜，然后将目镜测微尺的刻度朝下，旋好目透镜，并装上镜筒。n2，将镜台测微尺放在载物台上，刻度朝上，观察。n3，先低倍再高倍观察，旋转目镜测微尺，使其刻度与镜台测微尺刻度线平行。移动载物台推动器使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的一条刻度线重合，然后于另一端找重合线，计算两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各有几格，重复三次，按公式计算出目镜测微尺每格实际长度。n目镜测微尺每格长度（微米）=（镜台测微尺两重合线格数10 ） /目镜测微尺两重合线格数

13、n4，取出镜台测微尺，取酵母菌悬浮液1滴于载玻片上，盖上盖玻片，放在载物台上，进行测量菌体的大小（测20个菌体，求平均值）。今天的实验今天的实验n菌种：大肠杆菌、沙门菌、青霉菌种：大肠杆菌、沙门菌、青霉n采用无菌操作进行移植采用无菌操作进行移植n学会分区划线学会分区划线n所有平皿和试管必须有标记所有平皿和试管必须有标记n18182424小时（真菌下周观察）观察试验结小时（真菌下周观察）观察试验结果，描述固体培养和液体培养的细菌培养果，描述固体培养和液体培养的细菌培养特征特征步骤步骤n两个人为一组，一个接种两个人为一组，一个接种大肠杆菌大肠杆菌，一个，一个接种接种沙门菌沙门菌nLB液体移植液体移植n普通琼脂：分区划线普通琼脂：分区划线n麦康凯：分区划线麦康凯：分区划线n半固体：穿刺半固体：穿刺n克氏双糖：先穿刺后接种斜面克氏双糖：先穿刺后接种斜面n真菌（青霉）真菌（青霉）n接种沙保劳氏培养基接种沙保劳氏培养基实验报告n作业作业n1，根据使用显微镜写出：目镜倍数 ，物镜倍数 ，目镜测微尺两重合刻度 格，镜台测微尺两重合刻度 格，故目镜测微尺每格为 m。n2所测菌体，其长度为 m，宽 m 。思考题思考题1、无菌操作的关键步骤包括有哪些？